發(fā)布時間：2017-08-25 05:05

  本文關(guān)鍵詞：西伯利亞鱘卵黃發(fā)生過程中的生理調(diào)節(jié)機(jī)制與中華鱘EST文庫的生物信息學(xué)分析

  更多相關(guān)文章： 鱘科魚類 卵黃發(fā)生 血脂代謝 脂蛋白脂酶 卵黃蛋白原 克隆 蛋白表達(dá) 抗體制備

【摘要】：鱘魚現(xiàn)共存27種,是世界現(xiàn)存魚類中最原始的種類之一,隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)、鱘科(Acipenseridae)、鱘屬(Acipenser)。中華鱘(Aclpenser sinensis)是一種大型的溯河洄游性魚類,是我國特有的古老珍稀魚類。西伯利亞鱘(Acipenser baerii)主要分布在俄羅斯西部的顎畢河至東部的科雷馬河之間的西伯利亞各河流之中,已成功引進(jìn)到我國,并成為我國淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良新對象。鱘魚卵是魚籽醬的主要原材料,鱘魚卵子的發(fā)育情況直接關(guān)系到魚籽醬品質(zhì)的高低,對生產(chǎn)企業(yè)乃至養(yǎng)殖用戶的利潤水平具有重要影響。 卵黃發(fā)生期是動物卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的主要生長期,為卵母細(xì)胞及胚胎的正常發(fā)育儲存必需的氨基酸、脂類、鈣離子等營養(yǎng)功能性物質(zhì)以及能量,卵黃發(fā)生對動物的生殖發(fā)育至關(guān)重要。因此,對卵黃發(fā)生過程的生理調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究,不但能進(jìn)一步幫助了解鱘魚生長、繁殖和性別分化等方面的生理機(jī)制,同時可為鱘魚的保護(hù)和養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。 生物信息學(xué)的發(fā)展日新月異,已經(jīng)成為獲取更多與生物生長、發(fā)育、繁殖等相關(guān)分子信息的重要研究工具。對鱘魚現(xiàn)有的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析能夠得到很多有用的信息用于篩選和鑒定新基因,用于研究鱘魚生長發(fā)育過程中的分子機(jī)制。 本研究主要包括以下三個部分：1、西伯利亞鱘卵黃發(fā)生、激素調(diào)控及脂類代謝的研究 本部分以西伯利亞鱘為研究對象,對卵黃發(fā)生過程中卵巢發(fā)育、血液類固醇含量、血脂水平、血液脂酶活性、卵內(nèi)脂蛋白酯酶活性和血液中Ca2+及Pi水平進(jìn)行了研究分析。 血液中的雌二醇(E2)、睪酮(T)、總蛋白(TP)、極低密度脂蛋白(VLDL)、甘油三脂(TG)、Pi和Ca2+的含量從卵巢Ⅱ期(卵黃發(fā)生早期)開始逐漸上升,至Ⅳ期(卵黃發(fā)生晚期)達(dá)到最高,隨后開始下降�？偰懝檀�(TC)和低密度脂蛋白(LDL)的含量在整個卵巢發(fā)育過程中逐漸上升。卵中的脂蛋白脂酶(LPL)活性亦在Ⅳ期達(dá)到最高。研究結(jié)果提示E：在卵巢發(fā)育過程中起到啟動卵黃發(fā)生的作用,并且其水平從ⅡI期開始上升,調(diào)控卵黃蛋白原及脂類(VLDL、TG)的合成和分泌、調(diào)節(jié)卵巢中LPL的表達(dá)和酶活性。血液中Pi和Ca2+的含量間接的反映血液Vtg的變化。在卵巢Ⅳ期,血液中E2達(dá)到最高,促使血液中蛋白和脂類含量也增加到最高,保證卵母細(xì)胞中的卵黃蛋白的大量積累；卵巢內(nèi)的LPL活性在此時亦達(dá)到最高,說明脂類的積累在此時期增多。成熟后的卵母細(xì)胞停止積累營養(yǎng),E2的合成迅速降低,亦致使血液中蛋白、脂類以及卵巢LPL含量降低。 血液中脂類含量的變化,也受到血液LPL和肝脂酶(HL)的調(diào)控。血清中LPL和HL的活性在卵巢發(fā)育過程中逐漸升高,至V期(成熟的卵母細(xì)胞)時達(dá)到最高,隨后降低。根據(jù)血液脂酶和血脂相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn),血清LPL、HL與TG、VLDL、TC呈正相關(guān)關(guān)系,與高密度脂蛋白(HDL)呈弱負(fù)相關(guān)關(guān)系,說明西伯利亞鱘血清LPL和HL在卵巢發(fā)育過程中的血脂代謝途徑中起到了重要作用。同時血液LDL和HDL的代謝亦在卵巢發(fā)育過程中受到了兩種脂酶的影響。 2、西伯利亞鱘卵黃蛋白原基因的克隆及卵黃發(fā)生過程中血清卵黃蛋白原的檢測 本部分用三對引物從西伯利業(yè)鱘肝臟中克隆得到了卵黃蛋白原(vitellogenin, Vtg)成熟肽部分的cDNA。Vtg蛋白由脂磷蛋白I(LvⅠ)、高磷蛋白(Pv)和脂磷蛋白Ⅱ(LvⅡ)三個片段組成,分別包含了Vitellogenin、多聚絲氨酸和VWFD三個結(jié)構(gòu)域。將西伯利亞鱘Vtg的蛋白序列與多個物種的Vtg序列進(jìn)行多重比較,發(fā)現(xiàn)其與高首鱘Vtg的相似性最高為97.6%,與硬骨魚Vtg(分化為VtgAa、VtgAb和VtgC三個分支)的同源性較低�；赩tg蛋白序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)硬骨魚中分化為VtgAa和VtgAb兩支聚類到一起,先后與Vtg未分型的硬骨魚(包括鱘魚)、非洲爪蟾、原雞、七鰓鰻、硬骨魚VtgC相聚類,上述物種同屬于脊椎卵生動物,其Vtg進(jìn)一步與非脊椎動物的Vtg相聚。該進(jìn)化結(jié)果反映了物種間Vtg的進(jìn)化關(guān)系,符合生物之間的親緣關(guān)系。 通過E2誘導(dǎo)5月齡的西伯利亞鱘,發(fā)現(xiàn)肝臟Vtg基因可被誘導(dǎo)表達(dá),且與E2劑量呈正相關(guān),證明Vtg基因可受E2直接調(diào)控表達(dá),同時提示檢測不同發(fā)育時期Vtg基因的表達(dá)水平可以反映卵子發(fā)育的情況。但這種方法需要通過殺魚取肝,限制了應(yīng)用范圍,制備高效的Vtg抗體無疑能更好的解決這一問題。 因此,我們構(gòu)建了用于表達(dá)Lv I、Pv和LvⅡ的原核表達(dá)重組質(zhì)粒,并對異源表達(dá)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化。最后以純化的LvⅠ重組表達(dá)蛋白(Lv I E)為抗原制備了抗Vtg的特異性多克隆抗體。純化得到的抗Vtg抗體可高特異性地識別鱘魚血液中的Vtg。采用該抗體對西伯利亞鱘卵黃發(fā)生過程中不同發(fā)育時期血清Vtg的含量及其變化情況進(jìn)行了研究分析,得到的結(jié)果與西伯利亞鱘不同發(fā)育時期的血清Ca2+和Pi含量的變化趨勢相同,均呈“先上升,后下降”趨勢,在Ⅳ期達(dá)到最高。血液Vtg在卵巢發(fā)育過程中的變化趨勢說明在E2不斷的刺激下,肝臟不斷增加Vtg的合成,源源不斷為卵母細(xì)胞積累卵黃蛋白提供原料,直到卵母細(xì)胞成熟。利用Vtg抗體來檢測西伯利亞鱘血清中Vtg含量的變化,方法更加直接、靈敏、具有更好的區(qū)分度,能夠快捷、有效的判斷和掌握西伯利亞鱘卵巢發(fā)育的情況,在今后的研究、應(yīng)用中具有更廣闊的前景。 3、中華鱘EST文庫的生物信息學(xué)分析 為了更深入的研究鱘魚的生殖、發(fā)育和性別分化等分子機(jī)制,以"Acipenser sinensis"為關(guān)鍵詞對NCBI的EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,共得到了3384條來源于中華鱘腦垂體EST文庫的核酸序列。對所得到的ESTs序列進(jìn)行聚類拼接,共獲得861條獨(dú)立基因。將聚類拼接后的ESTs序列使用NCBI中的BLASTx程序進(jìn)行搜索,301條獨(dú)立基因與GenBank上公布的序列有較高同源性。其中202條基因是有功能注釋的基因；81條基因為推測功能基因；8條基因注釋為未知功能基因。其余560條獨(dú)立基因為新基因。進(jìn)一步進(jìn)行GO注釋,發(fā)現(xiàn)共有255個注釋基因和333個新基因可被功能分類。根據(jù)功能注釋結(jié)果,在數(shù)據(jù)源庫中發(fā)現(xiàn)了五種激素的核酸序列,分別為阿黑皮素原POMCA和POMC B、促性腺激素GtH-αI亞基和Ⅱ亞基以及生長激素GH,并且在ESTs文庫中具有較高豐度。GH、GtH-α、POMC在鱘魚各種類之間高度保守。為了研究基因的潛在功能,本研究檢測了CPH、PPIB、STMN3、7B2同4個豐度較高的新基因在中華鱘不同組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。通過對現(xiàn)有中華鱘EST文庫的注釋和分析,為進(jìn)一步研究提供了有用的基因組信息。
【關(guān)鍵詞】：鱘科魚類 卵黃發(fā)生 血脂代謝 脂蛋白脂酶 卵黃蛋白原 克隆 蛋白表達(dá) 抗體制備
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-35
• 1 卵子發(fā)生及卵黃發(fā)生的機(jī)制16-19
• 1.1 卵子發(fā)生16-18
• 1.2 卵黃發(fā)生機(jī)制18-19
• 2 卵黃發(fā)生過程中脂類的合成、代謝及在卵內(nèi)的積累19-25
• 2.1 血脂及血脂代謝19-23
• 2.2 卵中脂類的積累23-25
• 3 卵黃發(fā)生過程中卵黃蛋白原的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及在卵內(nèi)的積累25-31
• 3.1 卵黃蛋白原的合成途徑25-27
• 3.2 卵黃蛋白原在卵中的積累27-30
• 3.3 卵黃蛋白原的生物學(xué)功能30-31
• 4 表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用31-33
• 5 本研究的目的和意義33-35
• 第二章 西伯利亞鱘卵黃發(fā)生、激素調(diào)控及脂類代謝的研究35-54
• 1 前言35-36
• 2 材料和方法36-40
• 2.1 材料36-37
• 2.2 方法37-40
• 3 實驗結(jié)果40-50
• 3.1 西伯利亞鱘卵巢發(fā)育觀察40-42
• 3.2 西伯利亞鱘雌二醇和睪酮的變化規(guī)律42-43
• 3.3 血液離子在卵黃發(fā)生過程的變化規(guī)律43-44
• 3.4 血液蛋白及脂類在卵黃發(fā)生過程的變化規(guī)律44-47
• 3.5 血液脂蛋白脂酶和肝脂酶活性在卵黃發(fā)生過程的變化規(guī)律47-48
• 3.6 血清脂蛋白脂酶、肝脂酶與血液脂類的相關(guān)性48-49
• 3.7 卵黃發(fā)生過程中卵內(nèi)脂蛋白脂酶在卵中的酶活49-50
• 4 討論50-54
• 4.1 激素在卵黃發(fā)生過程中的作用50
• 4.2 卵黃發(fā)生過程中相關(guān)血液指標(biāo)與卵巢發(fā)育的關(guān)系50-52
• 4.3 卵黃發(fā)生過程中卵內(nèi)脂蛋白脂酶的作用52
• 4.4 卵黃發(fā)生過程中血液脂酶與脂類代謝的關(guān)系52-54
• 第三章 西伯利亞鱘卵黃蛋白原基因的克隆及卵黃發(fā)生過程中血清卵黃蛋白原含量的檢測54-94
• 1 前言54
• 2 材料和方法54-69
• 2.1 試驗材料54-56
• 2.2 方法56-69
• 3 實驗結(jié)果69-86
• 3.1 西伯利亞鱘卵黃蛋白原基因的克隆69-78
• 3.2 雌二醇誘導(dǎo)西伯利亞鱘肝臟卵黃蛋白原基因的表達(dá)78-79
• 3.3 西伯利亞鱘卵黃蛋白原蛋白部分片段的原核生物表達(dá)、純化79-84
• 3.4 西伯利亞鱘卵黃蛋白原抗體的制備84-85
• 3.5 西伯利亞鱘卵黃發(fā)生過程中血液卵黃蛋白原變化85-86
• 4 討論86-94
• 4.1 西伯利亞鱘卵黃蛋白原基因的序列特征的分析86-88
• 4.2 卵黃蛋白原的進(jìn)化特征88-89
• 4.3 雌二醇對西伯利亞鱘卵黃蛋白原基因表達(dá)影響89-90
• 4.4 西伯利亞鱘卵黃蛋白原抗體的制備90-91
• 4.5 卵黃蛋白原抗體的應(yīng)用前景91-94
• 第四章 中華鱘EST文庫的生物信息學(xué)分析94-109
• 1 前言94-95
• 2 材料和方法95-98
• 2.1 EST文庫分析和GO分析95
• 2.2 序列多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建95-96
• 2.3 激素相關(guān)基因和新基因組織特異性表達(dá)96-98
• 3 結(jié)果與討論98-109
• 3.1 中華鱘EST序列拼接98-100
• 3.2 中華鱘EST文庫獨(dú)立基因的功能注釋100-101
• 3.3 中華鱘獨(dú)立基因的GO(Gene Ontology)分析101-102
• 3.4 中華鱘EST文庫中的激素及與激素相關(guān)的基因102-104
• 3.5 中華鱘三種激素基因與其它物種基因多重比較及進(jìn)化樹構(gòu)建104-107
• 3.6 中華鱘一些基因的表達(dá)分析107-109
• 小結(jié)109-110
• 附錄110-116
• 參考文獻(xiàn)116-133
• 致謝133-134

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：735207