本文關(guān)鍵詞：擬南芥轉(zhuǎn)錄因子WRKY71對花和分枝發(fā)育的調(diào)控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

擬南芥轉(zhuǎn)錄因子WRKY71對花和分枝發(fā)育的調(diào)控機制研究

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在長期的進化過程中，植物形成了一套完整的機制，用于調(diào)節(jié)自身的生長發(fā)育以適應(yīng)或抵御外界生物和非生物脅迫，，在這些進程中轉(zhuǎn)錄因子(WRKY、DREB、NAC、MYB等)發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。
　　 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是近十幾年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它們在植物體內(nèi)是非組成型表達的，受生物及非生物脅迫(水楊酸、病原誘導(dǎo)子、高鹽、干旱、低溫等)誘導(dǎo)，主要參與生物與非生物脅迫應(yīng)答和植物衰老，有關(guān)對植物發(fā)育的調(diào)控研究報道很少，僅見參與調(diào)控了種子和表皮毛的發(fā)育。迄今為止，尚未見它們參與調(diào)控植物開花和分枝發(fā)育的報道。
　　 植物開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)折的關(guān)鍵，具有很強的可塑性。在各種外界環(huán)境和內(nèi)部因子的影響下，植物會選擇在適當?shù)臅r機開花進而獲得生殖的成功。植物開花是一個涉及多因子相互作用的復(fù)雜系統(tǒng)。目前，在擬南芥中主要存在4條調(diào)控植物開花的途徑：光周期途徑，春化途徑，自主途徑和赤霉素途徑。研究表明，其它一些因子也參與了開花調(diào)控，比如蔗糖和非生物脅迫因子。一些外界脅迫因子(干旱、紫外線和病原菌)能夠促進植物開花，這是植物逃避逆境的一種適應(yīng)機制。通常情況下，高鹽脅迫會抑制擬南芥開花，其調(diào)控機制已有一些研究。但尚未見有關(guān)高鹽脅迫促進植物開花的報道。
　　 植物的分枝是從莖頂端分生組織衍生出的腋生分生組織中分化出來的，包含兩個關(guān)鍵的發(fā)育過程：腋生分生組織在葉腋部位的形成和腋生分生組織的生長發(fā)育(腋/側(cè)芽的生長)。它決定著植物地上部分的株型，與作物的產(chǎn)量密切相關(guān)。植物的分枝發(fā)育受到各種外界環(huán)境條件、遺傳因素和植物激素的影響。目前，多個調(diào)控植物分枝發(fā)育的基因已被發(fā)掘。迄今，有關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物分枝發(fā)育的研究尚未見報道。
　　 本研究從擬南芥激活標簽突變體庫中篩選得到了一株較Col-0開花早、花器官大、植株矮小、分枝多的突變體D27。Tail-PCR和RT-PCR分析推測，該表型可能由WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因WRKY71的過表達引起。遺傳分析發(fā)現(xiàn)，該突變體的表型穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上，利用Col-0、D27(WRKY71-1D)及其敲除系wrky71-1研究了WRKY71在正常條件和高鹽脅迫下對擬南芥開花的作用，揭示了WRKY71介導(dǎo)高鹽誘導(dǎo)擬南芥開花提前的分子機制，分析了WRKY71對擬南芥分枝發(fā)育的貢獻及其可能機制，為進一步闡明擬南芥開花和分枝發(fā)育的分子調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 主要研究過程及實驗結(jié)果包括：
　　 1.WRKY71轉(zhuǎn)錄因子的分離鑒定及其功能初探
　　 1.1突變體的篩選和基因分離鑒定
　　 從擬南芥激活標簽突變體庫中，篩選得到了一株突變體D27，與野生型Col-0相比，該突變體植株矮小、開花早、花器官增大、分枝多。Tail-PCR和RT-PCR分析推測，該突變體的表型可能是由WRKY71的過表達引起。購買并篩選獲得了wrky71-1敲除系。
　　 1.2 WRKY71的表達模式
　　 時空表達模式：Real time-PCR分析發(fā)現(xiàn)，WRKY71在擬南芥Col-0生長的前三周內(nèi)表達逐步上調(diào)，隨后逐步下降；其在各個組織器官中均有表達，其中在角果中表達量最高。進一步的GUS染色分析發(fā)現(xiàn)，WRKY71亦在各組織器官中表達，在根、表皮毛及托葉中表達顯著。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，WRKY71定位于洋蔥表皮細胞和擬南芥原生質(zhì)體的細胞核中。轉(zhuǎn)錄激活活性實驗證實了該基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 對非生物脅迫和激素的應(yīng)答模式：Real time-PCR分析發(fā)現(xiàn)，WKRY71受高鹽和ABA的誘導(dǎo)而高表達，其由ABA依賴的途徑受高鹽誘導(dǎo)。
　　 1.3 WRKY71介導(dǎo)鹽脅迫下擬南芥的早開花
　　 以200mM NaCl處理在土壤中生長的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1植株(7天和10天各澆灌1L200mM NaCl)，發(fā)現(xiàn)WRKY71-1D在第23天開花，僅比正常條件下延遲1天，而Col-0和wrky71-1在第35天開花，比正常條件下延遲1周，說明WRKY71-1D的開花進程對高鹽不敏感。
　　 2.WRKY71調(diào)控擬南芥花發(fā)育的分子機制研究
　　 2.1 WRKY71促進擬南芥開花的確定
　　 WRKY71過表達植株35S：：WRKY71的表型與WRKY71-1D-致，佐證了WRKY71-1D的表型是由WRKY71過表達引起的。
　　 2.2 WRKY71在花序分生組織、花原基及花器官原基中表達
　　 RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)WRKY71在15天的花序分生組織和花原基中表達，在17天的花序分生組織和花器官原基中表達。表明WRKY71可能參與了頂端花序分生組織的形成以及花的發(fā)育。
　　 2.3 WRKY71促進開花轉(zhuǎn)折
　　 組織學(xué)縱向切片觀察發(fā)現(xiàn)花原基出現(xiàn)(開花轉(zhuǎn)折)的時間分別為：100％的WRKY71-1D在第11天、90.4±5.7％的Col-0在第15天、而僅有37.6±3.3％的wrky71-1在第15天。掃描電鏡結(jié)果同該結(jié)果一致，表明WRKY71具有促進擬南芥開花轉(zhuǎn)折的作用。
　　 2.4高鹽脅迫下WRKY71亦促進開花轉(zhuǎn)折
　　 組織學(xué)縱向切片分析發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫下花原基出現(xiàn)的時間分別為：100％的WRKY71-1D在第12天，32.7±3.3％的Col-0在第17天，而僅有21.6±2.9％的wrky71-1在17天，表明WRKY71-1D的開花起始幾乎不受到高鹽的抑制�？梢�，WRKY71在高鹽脅迫下亦促進開花轉(zhuǎn)折。
　　 綜上所述，WRKY71受高鹽的誘導(dǎo)，WRKY71的過表達促進擬南芥的開花，因此，推斷WRKY71介導(dǎo)了高鹽誘導(dǎo)擬南芥開花提前。
　　 2.5 WRKY71不參與四條主要開花途徑
　　 Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1均能正常應(yīng)答日照長度(長日照和短日照)、低溫和GA信號，在處理條件下，WRKY71-1D的開花時間依然早于Col-0和wrky71-1。四條途徑中的一些相關(guān)基因在三系中表達水平相近，而WRKY71在一些開花突變體(gi-2、co、ft、fve-4、ld-1、fld-1、fca-9)中的表達變化亦不明顯，表明WRKY71可能不參與上述4條途徑。
　　 2.6 WRKY71通過影響蔗糖運輸而促進擬南芥開花
　　 RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)蔗糖合成代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因在三系中的表達差異不明顯，表明WRKY71可能不影響擬南芥蔗糖的合成代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。蔗糖轉(zhuǎn)運子基因SUC8和SUC9在WRKY71-1D中表達下調(diào)，EMSA實驗證明WRKY71與SUC8和SUC9啟動子區(qū)的W-box結(jié)合，表明WRKY71通過直接抑制SUC8和SUC9的表達，促進胞外蔗糖運輸?shù)角o頂端以促進擬南芥的開花。
　　 2.7 WRKY71促進花分生組織決定基因表達
　　 Real time-PCR分析發(fā)現(xiàn)在非鹽脅迫和鹽脅迫條件下，花分生組織決定基因LFY、AP1、CAL和FUL在WRKY71-1D中均上調(diào)表達。這與WRKY71-1D在非鹽脅迫和鹽脅迫條件下開花早的表型一致。
　　 2.8 WRKY71結(jié)合LFY啟動子的W-box
　　 EMSA實驗證明WRKY71能強烈地結(jié)合在LFY啟動子的W-box上，微弱地結(jié)合在CAL啟動子的W-box上，不能與AP1啟動子的W-box結(jié)合；ChIP實驗亦證明了WRKY71能結(jié)合在LFY啟動子的W-box上，而不能與CAL結(jié)合，表明WRKY71通過直接上調(diào)LFY表達而促進擬南芥開花。
　　 2.9雜交互補驗證
　　 對WRKY71-1D×LFY：：GUS雜交種和LFY：：GUS進行GUS染色分析發(fā)現(xiàn)，前者的GUS活性高于后者，表明WRKY71可提高LFY的翻譯水平。
　　 WRKY71-1D×lfy植株與WRKY71-1D表型相似，但是不能開花結(jié)實，表明LFY的缺失阻斷了WRKY71-1D的開花，從而證實了WRKY71是通過調(diào)控上調(diào)LFY表達來促進擬南芥的開花。
　　 2.10 WRKY71促進擬南芥花器官的發(fā)育
　　 WRKY71-1D的萼片、花瓣、雄蕊和心皮均比Col-0和wrky71-1的大，其花器官發(fā)育快速。Real time-PCR分析發(fā)現(xiàn)，花器官發(fā)育相關(guān)基因AP1、AP3和AG，花器官大小的基因UFO和干細胞維持和分化相關(guān)基因WUS和CLV3在WRKY71-1D中表達上調(diào)。ChIP和EMSA實驗證明WRKY71僅能與AP3啟動子的W-box結(jié)合，而不能與UFO和WUS結(jié)合，表明WRKY71通過直接或間接地上調(diào)上述基因引起花器官發(fā)育提前和花器官增大。
　　 總之，擬南芥WRKY71通過直接上調(diào)LFY，間接上調(diào)AP1、CAL和FUL來促進開花起始；通過直接上調(diào)AP3，間接上調(diào)AP1和AG而促進花器官發(fā)育；間接上調(diào)UFO而促進花器官增大；間接上調(diào)WUS和CLV3而提高頂端分生組織活性而加快莖頂端分生組織干細胞的增殖和分化。
　　 3.WRKY71調(diào)控擬南芥分枝發(fā)育的功能研究
　　 3.1 WRKY71-1D突變體分枝數(shù)目增多
　　 對長日照下生長7周的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1進行了株高、角果數(shù)、分枝數(shù)目和附著枝數(shù)目統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)：三者的平均株高分別為34.2±3.4、9.1±0.6、34.7±2.8cm；平均結(jié)莢率分別為128.7±30.2、62.5±18.8、129.6±32.2個；分枝總數(shù)分別為55.1±6.1、27.3±2.3、25.3±3.6個；附著枝數(shù)分別為22.6±5.3、1.1±0.8、1.2±0.4個。
　　 3.2 WRKY71-1D的腋芽不休眠
　　 組織學(xué)縱向切片分析發(fā)現(xiàn)，WRKY71-1D植株腋芽出現(xiàn)在13天，15天時已膨大，而Col-0和wrky71-1在15天還未見腋芽發(fā)生。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，WRKY71-1D蓮座葉腋芽在21天已見花原基，而Col-0僅分化出葉子，wrky71-1僅見葉原基。生長至32天時，WRKY71-1D腋芽生長發(fā)育成側(cè)枝，而Col-0和wrky71-1側(cè)芽仍處于休眠狀態(tài)，表明WRKY71參與調(diào)控了擬南芥?zhèn)戎Φ男纬珊桶l(fā)育過程。
　　 3.3 WRKY71在葉腋處表達
　　 通過RNA原位雜交分析發(fā)現(xiàn)，WRKY71在Col-0的葉腋處表達，進一步表明WRKY71參與了擬南芥?zhèn)戎Φ男纬蛇M程。
　　 3.4 WRKY71促進分枝基因的表達
　　 調(diào)控分枝發(fā)育相關(guān)基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，WRKY71-1D中RAX2表達明顯的上調(diào)，LAS表達微弱的上調(diào)。EMSA實驗證明，WRKY71與RAX2啟動子的W-box結(jié)合，表明WRKY71通過直接上調(diào)RAX2而引起擬南芥的多分枝。
　　 3.5 WRKY71-1D維管束發(fā)育缺陷
　　 對Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1莖的橫切面結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，WRKY71-1D莖很細，僅有6個維管束，比Col-0少兩個；其束間形成層細胞層數(shù)比Col-0多1-2層，表明WRKY71-1D的莖維管束系統(tǒng)發(fā)育有缺陷。已知擬南芥維管束發(fā)育與生長素的功能密切相關(guān)，尤其是生長素運輸能力對維管束發(fā)育影響大，因此，推測WRKY71可能參與了生長素運輸?shù)恼{(diào)控。
　　 3.6 WRKY71促進生長素的運輸
　　 離體節(jié)點實驗分別將帶有腋芽的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1莖段上端插入含有1μM2，4-D的1/2MS培養(yǎng)基中，下端插入不含2，4-D的1/2MS培養(yǎng)基中，腋芽朝上培養(yǎng)7天，發(fā)現(xiàn)Col-0和wrky71-1腋芽有一定程度的伸長生長，而WRKY71-1D腋芽未見生長，推測在WRKY71-1D中側(cè)芽生長的抑制可能與其生長素運輸能力的增強有關(guān)。
　　 生長素運輸基因表達生長素運輸相關(guān)基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，PIN1在WRKY71-1D中上調(diào)表達，表明WRKY71可能通過提高生長素運輸能力對分枝發(fā)育起作用。
　　 3.7 WRKY71不影響生長素的生物合成
　　 分析生長素合成相關(guān)基因表達水平發(fā)現(xiàn)，NIT4和CYP7983在WRKY71-1D中下調(diào)表達。但HPLC分析發(fā)現(xiàn)，Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1中自由IAA含量相近，表明WRKY71不影響擬南芥體內(nèi)生長素的合成。
　　 3.8 WRKY71不影響生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　 將生長4天的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1轉(zhuǎn)入含10nM和1μM的IAA的1/2MS培養(yǎng)基上生長至14天，發(fā)現(xiàn)三系的主根、側(cè)根數(shù)目及其長度變化不大，表明WRKY71-1D能正常的響應(yīng)生長素信號。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在三系中表達差異不明顯，表明WRKY71可能不參與生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 結(jié)論，WRKY71通過直接上調(diào)RAX2引起了擬南芥分枝增多，通過提高生長素的運輸能力對分枝發(fā)育起作用。

作者 于延沖

學(xué)科專業(yè) 細胞生物學(xué)

授予學(xué)位 博士

授予單位 山東大學(xué)

導(dǎo)師姓名 向鳳寧

學(xué)位年度 2011

關(guān)鍵詞 擬南芥;轉(zhuǎn)錄因子;開花發(fā)育;分枝發(fā)育;生長素運輸;調(diào)控機制;高鹽脅迫

MeSH主題詞 植物組成部分地上(Plant Components, Aerial) 擬南芥屬(Arabidopsis) 體節(jié)(Somites) 形成層(Cambium) 花序(Inflorescence)

分類號 Q942.5

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