本文關(guān)鍵詞：麥長(zhǎng)管蚜翅型分化相關(guān)的生態(tài)學(xué)及microRNA水平的分子機(jī)理研究

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【摘要】：蚜蟲是研究翅二型性的理想模式昆蟲,可結(jié)合遺傳因素和環(huán)境因素變化研究翅分化機(jī)制。由于外界環(huán)境因子的影響,蚜蟲在發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)兩種不同的生物型,有翅蚜和無(wú)翅蚜。這種表觀形態(tài)的變化主要是由于受到環(huán)境因子的脅迫,通過(guò)選擇性地表達(dá)基因從而達(dá)到了調(diào)控的作用,這屬于典型的表觀遺傳學(xué)范疇。micro RNA(mi RNA)作為重要的后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子,參與生物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)生命過(guò)程,是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。隨著近年來(lái)大量昆蟲mi RNAs的鑒定,明確其在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用已成為新的研究熱點(diǎn),而且從mi RNA角度對(duì)昆蟲翅發(fā)育的研究也取得了一些進(jìn)展。因此,開(kāi)展麥長(zhǎng)管蚜翅型分化相關(guān)的生態(tài)學(xué)及mi RNA水平的分子機(jī)理方面的研究,為解析麥蚜的翅型分化機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)。本研究利用體視顯微鏡、掃描電鏡技術(shù)對(duì)麥長(zhǎng)管蚜不同翅型不同齡期成若蚜的形態(tài)測(cè)量學(xué)和外部形態(tài)特征進(jìn)行研究;通過(guò)設(shè)定不同的外界因子,對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究;運(yùn)用高通量測(cè)序和q RT-PCR等技術(shù),對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的mi RNA調(diào)控機(jī)理方面進(jìn)行了研究。主要得到以下研究結(jié)果:首先對(duì)麥長(zhǎng)管蚜不同翅型不同齡期成若蚜的形態(tài)測(cè)量學(xué)和外部形態(tài)特征進(jìn)行研究,結(jié)果表明麥長(zhǎng)管蚜1、2齡若蚜外部形態(tài)無(wú)明顯差別,觸角均為5節(jié);3齡有翅若蚜中胸發(fā)達(dá),可見(jiàn)初生翅芽,至成蟲期發(fā)育為完整的翅;3齡無(wú)翅若蚜中胸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,未見(jiàn)翅芽,3齡至成蚜觸角均為6節(jié);1齡若蚜尾片呈瘤狀,著生2根剛毛;2、3、4齡若蚜尾片呈圓錐形;有翅成蚜尾片呈長(zhǎng)錐形,無(wú)翅成蚜呈長(zhǎng)舌狀,2齡若蚜至成蚜尾片均著生6根以上剛毛;1齡到3齡若蚜腹管的外部形態(tài)基本相似,呈圓柱狀,4齡若蚜腹管端部開(kāi)始膨大,近端部變細(xì)。有翅成蚜和無(wú)翅成蚜腹管基本無(wú)差異,與若蚜相比,近頂端表面均呈現(xiàn)多角形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)設(shè)定不同的擁擠度、溫度、母代效應(yīng)、寄主營(yíng)養(yǎng)等因素,觀察對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化影響。結(jié)果表明初產(chǎn)若蚜的擁擠度越大,越有利于其形成有翅個(gè)體;較高的溫度和較低的溫度處理?xiàng)l件下,均有利于麥長(zhǎng)管蚜初齡若蚜有翅蚜的形成;擁擠處理母代,對(duì)后代個(gè)體的翅型分化存在影響,處理不同翅型的母代對(duì)后代個(gè)體翅型分化也存在差異;寄主營(yíng)養(yǎng)不僅影響當(dāng)代若蚜表型的變化,同樣影響第二代的表型變化。通過(guò)構(gòu)建麥長(zhǎng)管蚜有翅成蚜和無(wú)翅成蚜的mi RNAs文庫(kù),利用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法,測(cè)序結(jié)果中一共得到了146個(gè)保守的mi RNAs,152個(gè)新的mi RNAs,且34%以上的mi RNAs的長(zhǎng)度分布在22nt,這符合典型的mi RNAs長(zhǎng)度分布。采用數(shù)據(jù)歸一化和差異檢驗(yàn)方法(P值小于0.1、0.05以及0.01),篩選出52個(gè)表達(dá)差異顯著mi RNAs,其中30個(gè)上調(diào)控的mi RNAs和22個(gè)下調(diào)控的mi RNAs。通過(guò)預(yù)測(cè)差異表達(dá)的mi RNAs的靶基因,利用基因本體論GO、KEGG信號(hào)通路分析,初步篩選出可能與麥長(zhǎng)管蚜翅型分化相關(guān)的9個(gè)mi RNAs,包括7個(gè)保守的mi RNAs(Let-7、mi R-1_L-1、mi R-7、mi R-277、mi R-8、m R-9a_R-2和mi R-315)和2個(gè)新的mi RNAs(PC-5p-113190_15和PC-3p-2743_844)。通過(guò)q RT-PCR技術(shù)分析9個(gè)mi RNAs在兩翅型中的表達(dá)譜,結(jié)果表明9個(gè)mi RNAs在有翅成蚜中的表達(dá)量均高于無(wú)翅成蚜中的表達(dá)量,且有5個(gè)保守的mi RNAs(Let-7、mi R-1_L-1、mi R-7、mi R-277和mi R-8)的表達(dá)量差異顯著,推測(cè)這些mi RNAs可能在麥長(zhǎng)管蚜的翅型發(fā)育中起重要調(diào)控作用。通過(guò)構(gòu)建麥長(zhǎng)管蚜翅型分化敏感期(有翅蚜和無(wú)翅蚜的偽胚胎、1齡和2齡)的mi RNAs文庫(kù),經(jīng)過(guò)初步過(guò)濾篩選得到60%的clean數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。預(yù)測(cè)得到保守的pre-mi RNA 85個(gè),unique-mi RNA 150個(gè),新預(yù)測(cè)得到的新的pre-mi RNA 1050個(gè),unique mi RNA 1016個(gè)。通過(guò)差異檢驗(yàn)方法對(duì)兩兩數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異比對(duì),發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的mi RNAs。將預(yù)測(cè)得到的保守的mi RNAs與其他昆蟲的mi RNAs進(jìn)行保守性分析,表明其與鄰近物種豌豆蚜Acyrthosiphon pisum保守性較高,其次是赤擬谷盜Tribolium castaneum和家蠶Bombyx mori。通過(guò)q RT-PCR技術(shù)對(duì)9個(gè)mi RNAs在兩翅型不同齡期的表達(dá)譜進(jìn)行分析,表明不同mi RNAs在麥長(zhǎng)管蚜不同的翅型和不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量不同,進(jìn)一步地揭示mi RNAs表達(dá)的特異性和時(shí)序性。選擇兩個(gè)前期預(yù)測(cè)得到的可能與麥長(zhǎng)管蚜的翅型分化相關(guān)mi RNAs(mi R-7和mi R-277),根據(jù)mi RNA的成熟序列設(shè)計(jì),人工合成雙鏈小RNA(mi RNA agomir),通過(guò)模擬體內(nèi)mi RNA,與靶基因相互配對(duì),增強(qiáng)mi RNAs在體內(nèi)的表達(dá)。用人工飼料將mi RNA agomir稀釋至300 n M,將單頭飼養(yǎng)三代的無(wú)翅成蚜初產(chǎn)24 h內(nèi)的若蚜,每10頭放入含有相應(yīng)mi RNA agomir的飼蚜器中飼喂不同的時(shí)間。運(yùn)用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mi RNA agomir的過(guò)表達(dá)效應(yīng),結(jié)果表明,與對(duì)照相比,隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng),目的基因mi R-7和mi R-277的表達(dá)量也隨著增加。將飼喂不同時(shí)間的若蚜,單頭單株接入到新鮮的盆栽麥株上。4-5天后,觀察發(fā)現(xiàn)處理后的若蚜均能夠正常生長(zhǎng),未觀察到麥長(zhǎng)管蚜若蚜翅型分化比例的變化。
【關(guān)鍵詞】：麥長(zhǎng)管蚜 翅型分化 環(huán)境因素 microRNA 高通量測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.12
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-22
• 英文縮略表22-23
• 第一章 引言23-39
• 1.1 昆蟲翅發(fā)育的研究進(jìn)展24-27
• 1.2 影響蚜蟲翅型分化的因子27-29
• 1.2.1 外界因子27-28
• 1.2.2 內(nèi)部因子28-29
• 1.3 MicroRNA的研究概況29-32
• 1.3.1 MiRNA的作用機(jī)制31
• 1.3.2 MiRNA的研究方法31-32
• 1.4 MiRNA在昆蟲中的研究32-35
• 1.5 MiRNA在昆蟲翅型分化上的研究35-37
• 1.6 研究目的和意義37
• 1.7 研究?jī)?nèi)容與擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題37
• 1.7.1 研究?jī)?nèi)容37
• 1.7.2 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題37
• 1.8 技術(shù)路線37-39
• 1.8.1 外界因子對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的影響37-38
• 1.8.2 MiRNA對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的研究38-39
• 第二章 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型外部形態(tài)的比較39-52
• 2.1 試驗(yàn)材料39-40
• 2.1.1 供試?yán)ハx39
• 2.1.2 飼養(yǎng)皿的制備39
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器39-40
• 2.2 試驗(yàn)方法40
• 2.2.1 形態(tài)學(xué)測(cè)量40
• 2.2.2 掃描電鏡樣品的制備40
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析40
• 2.4 結(jié)果與分析40-49
• 2.4.1 麥長(zhǎng)管蚜有翅型與無(wú)翅型各齡期若蚜及成蚜形態(tài)測(cè)量比較40-43
• 2.4.2 麥長(zhǎng)管蚜不同齡期若蚜及成蚜中胸外部形態(tài)的比較43
• 2.4.3 麥長(zhǎng)管蚜不同齡期若蚜及成蚜觸角外部形態(tài)比較43-45
• 2.4.4 麥長(zhǎng)管蚜不同齡期若蚜及成蚜尾片外部形態(tài)的比較45
• 2.4.5 麥長(zhǎng)管蚜不同齡期若蚜及成蚜腹管外部形態(tài)的比較45-49
• 2.5 結(jié)論與討論49-51
• 2.5.1 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型各齡期若蚜及成蚜形態(tài)測(cè)量學(xué)研究49
• 2.5.2 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型各齡期若蚜及成蚜外部形態(tài)的研究49-51
• 2.6 小結(jié)51-52
• 第三章 外界因子對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的影響52-66
• 3.1 試驗(yàn)材料52-53
• 3.1.1 供試?yán)ハx52
• 3.1.2 飼養(yǎng)皿的制備52
• 3.1.3 全人工飼料配制52
• 3.1.4 飼蚜器的制備52-53
• 3.2 主要試劑和儀器53
• 3.3 試驗(yàn)方法53-55
• 3.3.1 擁擠效應(yīng)53
• 3.3.2 溫度效應(yīng)53
• 3.3.3 母代效應(yīng)53-54
• 3.3.4 營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)54-55
• 3.4 數(shù)據(jù)處理55
• 3.5 結(jié)果與分析55-64
• 3.5.1 不同擁擠度對(duì)麥長(zhǎng)管蚜初產(chǎn)若蚜翅型分化的影響55
• 3.5.2 溫度對(duì)麥長(zhǎng)管蚜初產(chǎn)若蚜翅型分化的影響55-57
• 3.5.3 母代效應(yīng)對(duì)麥長(zhǎng)管蚜若蚜翅型分化的影響57-58
• 3.5.4 寄主營(yíng)養(yǎng)對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的影響58-64
• 3.6 結(jié)論與討論64-65
• 3.7 小結(jié)65-66
• 第四章 麥長(zhǎng)管蚜有翅成蚜和無(wú)翅成蚜miRNAs的深度測(cè)序66-90
• 4.1 試驗(yàn)材料66-67
• 4.1.1 供試?yán)ハx66
• 4.1.2 主要數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件66-67
• 4.1.3 主要試劑和儀器67
• 4.2 試驗(yàn)方法67-70
• 4.2.1 總RNA樣本的提取67
• 4.2.2 麥長(zhǎng)管蚜miRNAs文庫(kù)的構(gòu)建和高通量測(cè)序67-68
• 4.2.3 MiRNAs生物信息學(xué)分析68
• 4.2.4 MiRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)68-69
• 4.2.5 兩樣本miRNAs的差異分析69
• 4.2.6 靶基因功能的預(yù)測(cè)和Pathway分析69-70
• 4.2.7 翅型分化相關(guān)miRNAs的篩選70
• 4.3 結(jié)果與分析70-87
• 4.3.1 RNA樣品質(zhì)量檢測(cè)70-71
• 4.3.2 麥長(zhǎng)管蚜miRNAs高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析71-75
• 4.3.3 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型miRNAs的鑒定75-76
• 4.3.4 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型中差異基因的篩選76-78
• 4.3.5 麥長(zhǎng)管蚜兩種翅型miRNAs的核酸偏移性分析78
• 4.3.6 麥長(zhǎng)管蚜兩個(gè)文庫(kù)中miRNAs的保守性分析78-80
• 4.3.7 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型中miRNAs的靶標(biāo)預(yù)測(cè)80-82
• 4.3.8 翅型分化相關(guān)的miRNAs的篩選及同源性分析82-87
• 4.4 結(jié)論與討論87-88
• 4.4.1 麥長(zhǎng)管蚜的miRNAs的一般特征87
• 4.4.2 麥長(zhǎng)管蚜保守的miRNAs和新的miRNAs87-88
• 4.4.3 MiRNAs的功能及靶標(biāo)預(yù)測(cè)88
• 4.4.4 與翅型分化相關(guān)的miRNAs的篩選88
• 4.5 小結(jié)88-90
• 第五章 麥長(zhǎng)管蚜翅型分化相關(guān)miRNAs的克隆及表達(dá)譜分析90-113
• 5.1 試驗(yàn)材料90-93
• 5.1.1 供試?yán)ハx90
• 5.1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源90-91
• 5.1.3 主要試劑91
• 5.1.4 主要溶液配置91
• 5.1.5 主要儀器設(shè)備91-92
• 5.1.6 引物設(shè)計(jì)92-93
• 5.2 試驗(yàn)方法93-98
• 5.2.1 總RNA的提取93-94
• 5.2.2 總RNA的檢測(cè)94
• 5.2.3 cDNA的合成94
• 5.2.4 RT-PCR反應(yīng)體系94-96
• 5.2.5 PCR產(chǎn)物的回收96
• 5.2.6 連接轉(zhuǎn)化96
• 5.2.7 PCR鑒定陽(yáng)性克隆及序列測(cè)定96-97
• 5.2.8 qRT-PCR定量分析97-98
• 5.2.9 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作98
• 5.2.10 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析98
• 5.3 結(jié)果與分析98-111
• 5.3.1 總RNA的提取98-99
• 5.3.2 MiRNA成熟序列的克隆99-100
• 5.3.3 內(nèi)參U6的克隆與序列分析100-102
• 5.3.4 9 個(gè)miRNAs及內(nèi)參U6上機(jī)檢測(cè)引物的特異性102-108
• 5.3.5 9 個(gè)miRNAs在兩翅型中的表達(dá)譜分析108-111
• 5.4 結(jié)論與討論111-112
• 5.5 小結(jié)112-113
• 第六章 有翅和無(wú)翅若蚜miRNAs的深度測(cè)序及相關(guān)miRNAs表達(dá)譜分析113-126
• 6.1 試驗(yàn)材料113-114
• 6.1.1 麥長(zhǎng)管蚜若蚜及成蚜的收集113-114
• 6.1.2 主要數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件114
• 6.1.3 主要試劑114
• 6.1.4 主要溶液配置114
• 6.1.5 主要儀器114
• 6.1.6 引物設(shè)計(jì)114
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法114-115
• 6.2.1 麥長(zhǎng)管蚜miRNAs文庫(kù)的構(gòu)建、高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析 . 926.2.2 總RNA的提取及檢測(cè)114
• 6.2.3 cDNA的合成114
• 6.2.4 RT-PCR反應(yīng)體系114
• 6.2.5 qRT-PCR定量分析114-115
• 6.2.6 數(shù)據(jù)分析115
• 6.3 結(jié)果與分析115-124
• 6.3.1 麥長(zhǎng)管蚜miRNAs高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析115-119
• 6.3.2 總RNA的提取及檢測(cè)119-120
• 6.3.3 9 個(gè)miRNAs在兩翅型不同齡期中的表達(dá)120-121
• 6.3.4 9 個(gè)miRNAs在兩翅型不同齡期中的表達(dá)譜分析121-124
• 6.4 結(jié)論與討論124-125
• 6.4.1 麥長(zhǎng)管蚜不同齡期miRNAs的一般特征124
• 6.4.2 9 個(gè)miRNAs在兩翅型不同齡期的表達(dá)譜分析124-125
• 6.5 小結(jié)125-126
• 第七章 翅型分化相關(guān)miRNAs的功能驗(yàn)證126-136
• 7.1 試驗(yàn)材料126-127
• 7.1.1 供試?yán)ハx126-127
• 7.1.2 主要試劑和儀器127
• 7.1.3 MiRNA agomir設(shè)計(jì)與合成127
• 7.2 試驗(yàn)方法127-128
• 7.2.1 miR-7 agomir和miR-277 agomir的飼喂127
• 7.2.2 總RNA的提取127-128
• 7.2.3 PCR檢測(cè)miRNAs在飼喂miRNA agomir后的表達(dá)128
• 7.2.4 qRT-PCR熒光定量檢測(cè)miRNA agomir的過(guò)表達(dá)128
• 7.2.5 MiRNAs過(guò)表達(dá)對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的影響128
• 7.2.6 數(shù)據(jù)分析128
• 7.3 結(jié)果與分析128-134
• 7.3.1 不同濃度miRNA agomir飼喂時(shí)間的死亡率128-130
• 7.3.2 總RNA提取及檢測(cè)130-132
• 7.3.3 PCR檢測(cè)miRNAs及內(nèi)參U6在各個(gè)處理樣品中的擴(kuò)增132
• 7.3.4 人工飼喂miRNA agomir對(duì)相應(yīng)mi RNAs表達(dá)量的影響132-134
• 7.3.5 飼喂miRNA agomir對(duì)麥長(zhǎng)管蚜若蚜表型的影響134
• 7.4 討論與結(jié)論134-135
• 7.5 小結(jié)135-136
• 第八章全文總結(jié)136-139
• 8.1 主要研究結(jié)果136-137
• 8.1.1 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型不同齡期形態(tài)學(xué)的比較136
• 8.1.2 外界因子對(duì)麥長(zhǎng)管蚜翅型分化的影響136
• 8.1.3 麥長(zhǎng)管蚜miRNAs文庫(kù)136-137
• 8.1.4 翅型分化相關(guān)的miRNAs表達(dá)譜分析及功能研究137
• 8.2 本研究的創(chuàng)新性137
• 8.3 下一步工作展望137-139
• 參考文獻(xiàn)139-154
• 致謝154-156
• 作者簡(jiǎn)歷156-157

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：588622