發(fā)布時(shí)間：2017-06-30 19:21

  本文關(guān)鍵詞：黃花蒿內(nèi)生放線菌資源及其對(duì)黃花蒿生長(zhǎng)和青蒿素生物合成的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】： 黃花蒿是一種重要的藥用植物,其代謝產(chǎn)物青蒿素不僅是目前有效的抗瘧藥物,還具有抗病毒、抗腫瘤等其他的藥用和農(nóng)用價(jià)值;但由于青蒿素產(chǎn)量極低,嚴(yán)重限制了其應(yīng)用范圍。植物內(nèi)生菌以其特殊的性質(zhì)成為我們尋找替代藥源和新活性物質(zhì)的重要來(lái)源。本研究以采自昆明的黃花蒿為對(duì)象,分析其內(nèi)生放線菌群落組成,從中發(fā)掘有應(yīng)用潛力的菌種資源和新物種資源;并對(duì)內(nèi)生放線菌與黃花蒿生長(zhǎng)及青蒿素生物合成之間的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。 本研究采用了四種方法進(jìn)行黃花蒿內(nèi)生放線菌的分離。首次將研磨珠均質(zhì)器和干熱處理運(yùn)用于內(nèi)生放線菌的分離。從黃花蒿全株樣品中共分離獲得內(nèi)生放線菌228株。結(jié)合形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列分析,將全部分離菌株鑒定到屬的水平,結(jié)果顯示它們分別屬于鏈霉菌屬、原小單孢菌屬、假諾卡氏菌屬、諾卡氏菌屬、野野村氏菌屬、紅球菌屬、韓國(guó)生工菌屬、小單孢菌屬、馬杜拉放線菌屬、鏈孢囊菌屬、擬無(wú)枝菌酸菌屬、指孢囊菌屬、芽生球菌屬、糖霉菌屬、考克氏菌屬、微球菌屬、戈登氏菌屬、游動(dòng)四孢菌屬共18個(gè)已知屬以及1個(gè)潛在新屬。分離頻率最高的是鏈霉菌,其次是原小單孢菌。 對(duì)其中6個(gè)候選新分類(lèi)單元的代表菌株進(jìn)行了包括形態(tài)與培養(yǎng)特征觀察、生理生化特性、細(xì)胞化學(xué)組分分析、基因組DNA G+C mol%、DNA同源性和基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析等在內(nèi)的多相分類(lèi)研究,確定了它們的分類(lèi)地位。菌株YIM 65646是小單孢菌科的一個(gè)新屬,被命名為植物單孢菌屬(Plantmonospora gen. nov.),典型種為內(nèi)生植物單孢菌(Plantmonospora endophytica sp. nov.)。菌株YIM 63111是假諾卡氏菌屬的一個(gè)新種,被命名為珍貴假諾卡氏菌(Pseudonocardia pretiosum sp. nov.)。菌株YIM 65594、YIM 65638、YIM 65642代表了鏈霉菌屬的一個(gè)新種,被命名為內(nèi)生鏈霉菌(Streptomyces endophytica sp. nov.),典型菌株為YIM 65594。YIM 65601為野野村氏菌屬的一個(gè)新種,被命名為內(nèi)生野野村氏菌(Nonomuraea endophytica)。 以上研究結(jié)果充分顯示黃花蒿體內(nèi)蘊(yùn)藏著大量豐富的放線菌菌種資源,其中也包括許多未被發(fā)掘的新物種資源。在此基礎(chǔ)上,我們對(duì)這些內(nèi)生放線菌的抗菌、酶活、除草活性及產(chǎn)生聚酮類(lèi)和非核糖體多肽類(lèi)物質(zhì)的潛力進(jìn)行了檢測(cè)。 采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抗菌活性檢測(cè),在228株內(nèi)生放線菌中有15.8%～34.6%的菌株分別對(duì)指示菌(金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、玉蜀黍長(zhǎng)蠕孢菌、燕麥鐮孢菌、炭疽病菌、蘋(píng)果腐爛病菌)具有抑制活性,其中有31株菌(13.6%)表現(xiàn)出較強(qiáng)的廣譜抗菌活性。 采用PCR擴(kuò)增法對(duì)166株菌進(jìn)行了PKS-I,PKS-II和NRPS基因的測(cè)定,獲得35株(21.1%)PKS-I基因陽(yáng)性的菌株,75株(45.2%)PKS-II基因陽(yáng)性的菌株,擴(kuò)增出NRPS基因的有54株(32.5%)。 用平板篩選的方法,對(duì)199株菌進(jìn)行了酶活檢測(cè),從中篩選到7株淀粉酶活性較強(qiáng)的菌株,10株蛋白酶活性較強(qiáng)的菌株,1菌株具有較強(qiáng)的脂肪酶活性(菌落邊緣至透明圈邊緣的距離0.5cm);7株纖維素酶活性較強(qiáng)的菌株(菌落邊緣至透明圈邊緣的距離≥1.0cm)。 選取117株代表性菌株,對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行稗草萌發(fā)的抑制活性檢測(cè),其中有19株菌(16.2%)能完全抑制稗草發(fā)芽。 首次對(duì)黃花蒿內(nèi)生放線菌資源進(jìn)行系統(tǒng)的活性評(píng)價(jià),研究結(jié)果證實(shí)了內(nèi)生放線菌確實(shí)是一類(lèi)具有天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)潛力的重要資源。從中我們也獲得了一批值得后續(xù)研究的菌株。 通過(guò)回接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),32個(gè)菌株對(duì)黃花蒿幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出了不同的影響。大多數(shù)菌株不影響幼苗的生長(zhǎng);其中6個(gè)菌株對(duì)幼苗的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用;4株菌對(duì)黃花蒿幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用,其中菌株YIM 63111的抑制作用最為強(qiáng)烈。 開(kāi)展了回接處理后,青蒿素合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)水平的定量分析,以及青蒿素含量的檢測(cè)。結(jié)果表明在一定回接處理濃度下,菌株YIM 63111能誘導(dǎo)無(wú)菌培養(yǎng)條件下和溫室培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的黃花蒿植株的CYP71AV1和CPR基因表達(dá)水平顯著上調(diào),使青蒿素含量提高了30%～40%。這是首次發(fā)現(xiàn)內(nèi)生放線菌對(duì)青蒿素的生物合成有誘導(dǎo)作用。 首次采用egfp標(biāo)記內(nèi)生的假諾卡氏菌YIM 63111,進(jìn)行回接定殖研究。結(jié)果顯示在回接14天后,該菌株在黃花蒿幼苗根表面和內(nèi)部均有定殖。 本研究揭示了黃花蒿內(nèi)生放線菌的部分生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性,對(duì)于開(kāi)發(fā)內(nèi)生放線菌的活性代謝產(chǎn)物,認(rèn)識(shí)內(nèi)生菌與植物之間的關(guān)系,利用內(nèi)生放線菌促進(jìn)黃花蒿的生長(zhǎng)、提高青蒿素含量具有一定的指導(dǎo)作用。
【關(guān)鍵詞】：黃花蒿 內(nèi)生放線菌 多樣性 生物活性 青蒿素 回接實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：S567.219
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第一章 研究背景及選題依據(jù)13-35
• 1 植物內(nèi)生菌概述13-15
• 2 內(nèi)生放線菌研究現(xiàn)狀15-30
• 2.1 內(nèi)生放線菌物種多樣性16-20
• 2.2 內(nèi)生放線菌代謝產(chǎn)物研究20-23
• 2.3 內(nèi)生放線菌生態(tài)學(xué)特性研究23-30
• 2.4 內(nèi)生放線菌的應(yīng)用價(jià)值30
• 3 黃花蒿及其內(nèi)生菌30-33
• 3.1 黃花蒿藥用價(jià)值30-31
• 3.2 提高青蒿素產(chǎn)量的生物技術(shù)途徑31-32
• 3.3 黃花蒿內(nèi)生菌研究現(xiàn)狀32-33
• 4 本研究的目的意義及思路33-35
• 第二章 黃花蒿內(nèi)生放線菌分離及初步鑒定35-49
• 1 材料與方法35-39
• 1.1 植物材料35
• 1.2 清洗植物樣品35
• 1.3 表面消毒35-36
• 1.4 分離培養(yǎng)基36
• 1.5 分離程序36-37
• 1.6 菌株的初步歸類(lèi)37
• 1.7 基因組DNA 提取37
• 1.8 16S rRNA 基因的擴(kuò)增及測(cè)序37-38
• 1.9 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析38-39
• 2 結(jié)果與討論39-48
• 2.1 表面消毒效果的檢驗(yàn)39
• 2.2 黃花蒿內(nèi)生放線菌資源的物種組成分析39-43
• 2.3 部分菌株序列相似性分析43-45
• 2.4 分離效果的比較45-48
• 3 本章小結(jié)48-49
• 第三章 潛在新分類(lèi)單元的多相分類(lèi)49-94
• 1 材料與方法49-64
• 1.1 實(shí)驗(yàn)菌株49
• 1.2 形態(tài)和培養(yǎng)特征49-50
• 1.3 生理生化特征50-51
• 1.4 化學(xué)分類(lèi)特征51-62
• 1.5 分子分類(lèi)62-64
• 2 結(jié)果分析64-93
• 2.1 假諾卡氏菌屬一個(gè)新種的多相分類(lèi)研究64-69
• 2.2 小單孢菌科一個(gè)新屬的多相分類(lèi)研究69-78
• 2.3 鏈霉菌屬一個(gè)新種的多相分類(lèi)研究78-86
• 2.4 野野村氏菌屬一個(gè)新種的多相分類(lèi)研究86-93
• 3. 本章小結(jié)93-94
• 第四章 黃花蒿內(nèi)生放線菌的生物活性94-116
• 1 材料與方法94-97
• 1.1 實(shí)驗(yàn)菌株94-95
• 1.2 病原指示菌、植物種子95
• 1.3 菌株發(fā)酵95
• 1.4 抑菌檢測(cè)95
• 1.5 PKS 和NRPS 基因測(cè)定95-96
• 1.6 酶活檢測(cè)96-97
• 1.7 稗草種子萌發(fā)抑制作用初測(cè)97
• 2 結(jié)果與討論97-115
• 2.1 抗菌活性97-102
• 2.2 PKS 和NRPS 基因的測(cè)定結(jié)果102-106
• 2.3 產(chǎn)酶能力測(cè)定106-113
• 2.4 稗草種子萌發(fā)抑制作用113-115
• 3 本章小結(jié)115-116
• 第五章 內(nèi)生放線菌對(duì)黃花蒿幼苗生長(zhǎng)的影響116-124
• 1 材料與方法116-118
• 1.1 供試菌株116
• 1.2 黃花蒿幼苗的培養(yǎng)116-118
• 1.3 內(nèi)生放線菌的回接118
• 1.4 生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定118
• 1.5 回接菌株再分離實(shí)驗(yàn)118
• 2 結(jié)果與討論118-123
• 2.1 回接菌株生長(zhǎng)情況118
• 2.2 菌株再分離實(shí)驗(yàn)118-120
• 2.3 回接菌株對(duì)黃花蒿幼苗生長(zhǎng)的影響120-123
• 3 本章小結(jié)123-124
• 第六章 黃花蒿內(nèi)生放線菌對(duì)青蒿素生物合成的影響及回接定殖初探124-146
• 1 材料與方法125-129
• 1.1 青蒿素提取及檢測(cè)125-126
• 1.2 菌株YIM 63654 和YIM 63673 回接無(wú)菌培養(yǎng)黃花蒿幼苗126
• 1.3 菌株YIM 63111 回接無(wú)菌培養(yǎng)黃花蒿幼苗126
• 1.4 菌株YIM 63111 回接溫室培養(yǎng)黃花蒿幼苗126
• 1.5 Real Time RT-PCR126-127
• 1.6 相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析127-128
• 1.7 顯微觀察128
• 1.8 構(gòu)建egfp 標(biāo)記的菌株YIM 63111128
• 1.9 回接觀察egfp 標(biāo)記的菌株YIM 63111128-129
• 2 結(jié)果與分析129-142
• 2.1 第一輪實(shí)驗(yàn)中青蒿素含量檢測(cè)結(jié)果129
• 2.2 第二次回接實(shí)驗(yàn)中菌株再分離結(jié)果129-130
• 2.3 菌株YIM 63654 和YIM 63673 回接處理對(duì)青蒿素積累的影響130
• 2.4 菌株YIM 63111 對(duì)青蒿素生物合成的影響130-137
• 2.5 掃描電鏡觀察菌株YIM 63111 定殖情況137-139
• 2.6 構(gòu)建egfp 標(biāo)記的菌株YIM 63111 并觀察其定殖情況139-142
• 3 討論142-145
• 4 本章小結(jié)145-146
• 總結(jié)與展望146-148
• 參考文獻(xiàn)148-169
• 附錄169-177
• 攻讀博士學(xué)位期間的成果目錄177-181
• 致謝181

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：503228