本文關(guān)鍵詞：玫瑰孢鏈霉菌多效調(diào)控基因whiB4對菌體生長發(fā)育和達托霉素生物合成的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 達托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)發(fā)酵產(chǎn)生的一種脂肽類抗生素。2003年獲美國FDA批準(zhǔn)用于治療革蘭氏陽性菌引起的復(fù)雜皮膚感染和結(jié)構(gòu)性皮膚感染。2006年美國FDA又批準(zhǔn)了達托霉素的新適應(yīng)癥,用于治療由金黃色葡萄球菌引起的菌血癥和右側(cè)心內(nèi)膜炎。達托霉素對高致病耐藥菌,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)等均有很好的殺菌效果,且毒副作用小,它已成為病原菌最后一道防線一萬古霉素的最佳替代品,發(fā)展前景廣闊。 whiB家族是僅存在放線菌中與菌體生長發(fā)育和次級代謝密切相關(guān)的一組基因,whiB4是其家族成員之一。研究表明whiB4低表達能夠提高阿霉素／柔紅霉素、默諾霉素、放線紫紅素等多種抗生素的生物合成,而高表達則降低了抗生素的產(chǎn)量。這暗示whiB4可能是抗生素生物合成的負調(diào)控基因,是通過基因工程途徑提高抗生素產(chǎn)量的一個重要候選基因。本研究經(jīng)過生物信息學(xué)分析,從玫瑰孢鏈霉菌基因組中克隆到了whiB4,并研究其對玫瑰孢鏈霉菌發(fā)育分化、達托霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響,為提高達托霉素發(fā)酵產(chǎn)量提供新靶點。 目的： 本文旨在研究Streptomyces roseosporus NRRL15998中whiB4對菌體生長發(fā)育及達托霉素生物合成的影響,為Streptomyces roseosporus的菌種改造和提高達托霉素產(chǎn)量尋找新靶點。 方法： 1.優(yōu)化大腸桿菌介導(dǎo)的Streptomyces roseosporus遺傳轉(zhuǎn)化條件,如接合轉(zhuǎn)移的最佳培養(yǎng)基、孢子的預(yù)萌發(fā)條件、抗生素覆蓋時間等。 2.通過生物信息學(xué)分析在Streptomyces roseosporus NRRL15998基因序列中找到whiB4,設(shè)計引物克隆得到目的基因,分別以pKC1139(?)(?)pSET152為基礎(chǔ)構(gòu)建whiB4的敲除質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒。 3.通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入Streptomyces roseosporus NRRL15998中,篩選whiB4的敲除株,過表達突變株和遺傳互補株,并發(fā)酵檢測達托霉素產(chǎn)量。 RT-qPCR檢測與達托霉素生物合成起始相關(guān)基因dptE的轉(zhuǎn)錄水平變化。 4.通過發(fā)酵菌體收集、固體培養(yǎng)和掃描電鏡觀察Streptomyces roseosporus的菌體生長,孢子形成情況。 結(jié)果： 1.優(yōu)化了Streptomyces roseosporus的接合轉(zhuǎn)移體系,顯示AS-1培養(yǎng)基是接合轉(zhuǎn)移的最佳培養(yǎng)基。孢子的預(yù)萌發(fā)條件為50℃熱激10min,抗生素覆蓋時間16-18h效果最好。轉(zhuǎn)化效率達10-6～10-5。 2.從Streptomyces roseosporus NRRL15998的基因組中克隆到了、vhiB4基因,成功構(gòu)建了whiB4敲除載體和過表達載體。接合轉(zhuǎn)移后,篩到陽性菌株,PCR驗證確定了whiB4的阻斷突變株(whiB4DM)和過表達突變株(whiB4152OM)。 3.發(fā)酵檢測達托霉素產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)whiB4DM較WT產(chǎn)抗能力增加43%,回補株達托霉素產(chǎn)量降低21%。whiB4過表達后,達托霉素產(chǎn)量降低55%。RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)whiB4DM中dptE基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。 4. whiB4DM突變株的孢子形成受阻,菌絲細長不能分隔形成孢子,但是whiB4的敲除并沒有顯著影響發(fā)酵過程中菌體的生長。 結(jié)論： 大量研究表明whiB-like基因可能是抗生素生物合成的負調(diào)控基因,也是與孢子形成相關(guān)的一個重要基因。在Streptomyces roseosporus NRRL15998中whiB4的阻斷,抑制了孢子的形成,但促進了達托霉素的生物合成,說明whiB4調(diào)控玫瑰孢鏈霉菌孢子的形成,也是達托霉素生物合成的負調(diào)控基因,可能通過調(diào)控達托霉素生物合成基因發(fā)揮作用,這與之前的研究結(jié)果相符。本研究將有助于拓展我們對達托霉素生物合成調(diào)控的認識,為代謝工程更好的進行菌種改造提供重要理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：達托霉素 S.roseosporus whiB4 孢子 dptE
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R914
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第1章 綜述10-20
• 1.1 達托霉素概述10-16
• 1.1.1 達托霉素的理化性質(zhì)10
• 1.1.2 達托霉素抑菌活性和作用機制10-12
• 1.1.3 達托霉素的臨床研究及應(yīng)用12-14
• 1.1.4 達托霉素的生物合成14-16
• 1.2 達托霉素產(chǎn)生菌S.roseosporus的代謝工程改造16-17
• 1.2.1 提高達托霉素產(chǎn)量16
• 1.2.2 尋找達托霉素結(jié)構(gòu)類似物16-17
• 1.3 whiB-like(wbl)基因家族17-20
• 1.3.1 wbl基因家族的發(fā)現(xiàn)17
• 1.3.2 wbl基因家族的生物學(xué)功能17-20
• 第2章 緒論20-22
• 第3章 實驗材料和方法22-36
• 3.1 材料22-25
• 3.1.1 菌株及質(zhì)粒22
• 3.1.2 培養(yǎng)基22-23
• 3.1.3 常用抗生素23-24
• 3.1.4 引物24-25
• 3.1.5 實驗試劑25
• 3.1.6 主要儀器25
• 3.2 實驗方法25-36
• 3.2.1 常規(guī)實驗方法25-29
• 3.2.2 接合轉(zhuǎn)移體系的優(yōu)化29-30
• 3.2.3 whiB4敲除突變株和過表達菌株的構(gòu)建和篩選30-31
• 3.2.4 達托霉素生物活性檢測以及菌體生長曲線測定31-32
• 3.2.5 RNA提取,RT-PCR,RT-qPCR32-36
• 第4章 實驗結(jié)果與分析36-50
• 4.1 S roseosporus遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化36-39
• 4.1.1 抗生素最小抑菌濃度(MIC)的測定36
• 4.1.2 培養(yǎng)基對接合轉(zhuǎn)移的影響36
• 4.1.3 抗生素覆蓋時間和受體孢子數(shù)對接合轉(zhuǎn)移的影響36-37
• 4.1.4 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性考察37
• 4.1.5 接合轉(zhuǎn)移接合子的驗證37-38
• 4.1.6 安普霉素抗性基因的特異性敲除38-39
• 4.2 S roseosporus15998 whiB4基因的克隆和生物信息學(xué)分析39-40
• 4.3 whiB4敲除和過表達載體的構(gòu)建40-41
• 4.4 whiB4突變菌株的篩選41-43
• 4.4.1 whiB4敲除突變株的篩選41-42
• 4.4.2 whiB4過表達菌株的篩選42-43
• 4.4.3 whiB4敲除突變株的遺傳互補43
• 4.5 whiB4敲除突變株的表型觀察43-44
• 4.6 whiB4阻斷和過表達對達托霉素生物合成的影響44-47
• 4.6.1 whiB4敲除對達托霉素生物合成的影響44-46
• 4.6.2 whiB4過表達對達托霉素生物合成的影響46-47
• 4.7 基因dptE和whiB4轉(zhuǎn)錄水平差異分析47-50
• 4.7.1 總RNA的提取47
• 4.7.2 基因dptE和whiB4轉(zhuǎn)錄水平檢測及分析47-50
• 第5章 討論與展望50-54
• 5.1 whiB4對S.roseosporus15998生長發(fā)育的影響50-51
• 5.2 whiB4對達托霉素生物合成的影響51
• 5.3 展望51-54
• 參考文獻54-60
• 碩士期間發(fā)表論文和獎勵情況60-62
• 致謝62-63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 楊e

本文編號：470976