發(fā)布時間：2017-05-30 11:09

  本文關(guān)鍵詞：西瑪津?qū)蓷惏l(fā)育影響的分子生物學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：西瑪津(Simazine,2-Chloro-4,6-bis Ethylamino-1,3,5-Triazine)是一種在農(nóng)業(yè),園藝和休閑場所廣泛應(yīng)用的三嗪除草劑。該除草劑從1955被研發(fā)上市。西瑪津能夠通過化學(xué)、光催化或者生物過程進(jìn)行降解。降解研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)西瑪津在土壤和水中的半衰期在幾天和150天間變化。溫度和濕度能夠影響西瑪津的半衰期,低溫和干燥能夠延長降解時間。2009年,美國環(huán)�？偩骤b于西瑪津的多重暴露途徑和高生產(chǎn)量,將其列入內(nèi)分泌干擾物篩選計劃(EDSP)。在中國,西瑪津也是一種在地下水和地表水中經(jīng)常被檢測到的除草劑。內(nèi)分泌干擾物是指由能夠干擾天然荷爾蒙的合成、分泌、運輸、結(jié)合、活性的外源物質(zhì),從而導(dǎo)致有關(guān)體內(nèi)平衡、生殖、發(fā)育和行為的異常。研究顯示,西瑪津?qū)儆趦?nèi)分泌干擾物(EDCs),在體外的抗雄激素篩選實驗中西瑪津表現(xiàn)出了刺激效應(yīng)；在動物實驗中,西瑪津?qū)Χ鄠�物種的生長、發(fā)育、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)都產(chǎn)生了不利影響,包括對哺乳類和兩棲類的生殖系統(tǒng)毒性。西瑪津由于其在土壤和水中的高殘留,在美國、歐洲和澳大利亞的地表水和地下水中是經(jīng)常被檢測到的第二類物質(zhì),在我國河流和出廠水中也時常被檢測到。西瑪津在地表水和地下水中的濃度因為會受到季節(jié)和被調(diào)查地區(qū)使用以西瑪津為基本成分的除草劑的范圍的影響,所以是可變的。在美國西瑪津在地表水中的濃度可以高達(dá)1300 μg/L,在地下水中高達(dá)800 μg/L。根據(jù)WHO的水純凈標(biāo)準(zhǔn),自來水中西瑪津的濃度達(dá)到2μg/L時便被認(rèn)為是污染水。所以,本研究將西瑪津的濃度設(shè)為0.1、1、10和100 μg/L,該濃度梯度包括了從低到高多個西瑪津的環(huán)境相關(guān)濃度,確保高濃度的西瑪津能夠?qū)嶒瀯游锂a(chǎn)生發(fā)育毒性,以便進(jìn)一步的對其毒性作用機(jī)制進(jìn)行研究。兩棲類具有復(fù)雜的生活周期和滲透性的皮膚,能通過多路徑暴露于陸地和水體中的環(huán)境污染物,這些特性使他們成為一種檢測內(nèi)分泌干擾物暴露和相關(guān)作用的理想的模式生物。同時,環(huán)境污染是導(dǎo)致近年來全球兩棲類數(shù)量大量減少的主要原因。兩棲類成為當(dāng)今世界上生存形式最為嚴(yán)峻的群體。因此,為了保證兩棲類的種群延續(xù)和生態(tài)健康,從多水平研究內(nèi)分泌干擾物對兩棲類生長發(fā)育的影響已成為必然。本論文的目的是在研究西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍和非洲爪蟾的生長發(fā)育產(chǎn)生陽性有害影響的前提下,對其相關(guān)聯(lián)的分子水平的改變進(jìn)行研究。本研究分別以本地種兩棲動物中華大蟾蜍和模式種兩棲動物非洲爪蟾為動物模型,研究西瑪津?qū)@兩個物種生長發(fā)育的影響、以及西瑪津?qū)Ψ侵拮傅母闻K相關(guān)基因(vtga2、ar、er、gr、hsp70、hsp90)表達(dá)水平和雄性性腺組織的雜交微陣列芯片表達(dá)譜的影響。通過基因表達(dá)的性能分析來探索介導(dǎo)外源雌激素對非洲爪蟾不利影響的分子路徑和細(xì)胞過程。初步推測西瑪津?qū)蓷惏l(fā)育毒性的信號通路和作用機(jī)制,為在分子水平的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。中華大蟾蜍暴露西瑪津的實驗設(shè)0.01% DMSO對照組和4個西瑪津染毒組(0.1、1、10和100 μg/L)。每個劑量組隨機(jī)挑選發(fā)育到第25/26期的正常蝌蚪144只蝌蚪,平均放入8個25×20×20 cm3的平行缸中暴露85 d。在暴露期間,每天記錄動物的生長發(fā)育情況、死亡數(shù)、變態(tài)情況；染毒結(jié)束后,進(jìn)行性腺的組織病理學(xué)切片的制作和觀察；對中華大蟾蜍的一般生長發(fā)育指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。結(jié)果顯示,10和100 μg/L西瑪津?qū)е轮腥A大蟾蜍蝌蚪死亡率顯著升高(p0.01,分別是對照組的2.17和2.86倍)；西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍的一般生長情況(體重、體長)無顯著性影響(p0.05)；在各時間點對非洲爪蟾蝌蚪前腿發(fā)生的百分比無顯著性的抑制(p0.05),但10和100 μg/L西瑪津使中華大蟾蜍蝌蚪后腿的伸展時間顯著延長,與對照組相比分別延長了2.1%(p0.05)和6.9%(p0.01)；西瑪津抑制了中華大蟾蜍蝌蚪變態(tài),各暴露組在實驗結(jié)束時皆有少數(shù)處于38-40期的發(fā)育異常個體；西瑪津?qū)е轮腥A大蟾蜍卵巢組織的卵細(xì)胞溶解、壞死,形成空泡,生殖細(xì)胞減少,睪丸組織中出現(xiàn)睪丸卵母細(xì)胞；西瑪津暴露組中出現(xiàn)了發(fā)育顯著遲緩無法辨認(rèn)性別的性腺；暴露組的中華大蟾蜍性別比與對照組的相比未見顯著差異(p0.05)；西瑪津暴露各組中均未見異常性腺形態(tài)。非洲爪蟾暴露西瑪津的實驗也設(shè)0.01% DMSO對照組和4個西瑪津染毒組(0.1、1、10和100μg/L)。每個劑量組隨機(jī)挑選發(fā)育至46/47階段的健康蝌蚪120只,平均放入8個25×20×20 cm3的平行缸中暴露100 d。在暴露期間,每天記錄動物的生長發(fā)育情況、死亡數(shù)和變態(tài)情況。染毒結(jié)束后,制作非洲爪蟾性腺和肝臟的組織病理學(xué)切片并鏡下觀察；對爪蟾的一般生長發(fā)育指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理；采用Q-RT-PCR對雌雄爪蟾肝臟相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行檢測；在100 μg/L西瑪津暴露組雄性非洲爪蟾的生殖系統(tǒng)生理學(xué)和毒理學(xué)終點具有顯著性改變的基礎(chǔ)上,采用非洲爪蟾全基因組芯片(Agilent Xenopus 4x44K Gene Expression Microarrays)對雄性非洲爪蟾性腺組織進(jìn)行基因表達(dá)譜研究。根據(jù)差異基因的功能角色和FC值,從結(jié)果中選取15個關(guān)鍵基因,采用Q-RT-PCR方法對表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。然后,采用生物信息學(xué)技術(shù)GO分析和pathway分析對復(fù)雜的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行處理轉(zhuǎn)換。尋求改變的生理學(xué)和毒理學(xué)終點與基因表達(dá)改變的關(guān)聯(lián)性。西瑪津?qū)Ψ侵拮妇哂忻黠@的發(fā)育毒性。10和100μg/L西瑪津?qū)е路侵拮傅乃劳雎式员葘φ战M顯著升高64.3%(p0.05)。西瑪津?qū)Ψ侵拮傅捏w重和體長沒有影響(p0.05)。10和100μg/L西瑪津使雄性非洲爪蟾的睪丸重量和GSI與對照組相比皆顯著下降57.1%(p0.05)。雌性爪蟾的卵巢重量和GSI未受影響(p0.05)；西瑪津沒有影響非洲爪蟾卵巢組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育,但對睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響顯而易見。暴露各組的睪丸切片中出現(xiàn)了不規(guī)則排列的曲細(xì)精管、腫脹的精原細(xì)胞和大量的空腔結(jié)構(gòu)。100μg/L組尤為顯著,出現(xiàn)精原細(xì)胞腫脹、部分曲細(xì)精管出現(xiàn)固縮和壞死、核濃染和片狀結(jié)構(gòu)；暴露各組的睪丸組織中出現(xiàn)沿著頭尾軸不連續(xù)發(fā)育的異常節(jié)段；西瑪津沒有誘導(dǎo)非洲爪蟾產(chǎn)生性別比異常。分別統(tǒng)計暴露期的第60、70、80和90 d西瑪津暴露各組中完全變態(tài)的非洲爪蟾數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在60和70 d時,西瑪津?qū)Ψ侵拮蛤蝌降淖儜B(tài)百分比無有顯著性的抑制(p0.05),10μg/L西瑪津暴露組蝌蚪在第80 d的時間點完全變態(tài)百分?jǐn)?shù)顯著低于對照組8.1%(p0.05),第90 d的時間點爪蟾完全變態(tài)百分?jǐn)?shù)與對照組的相比差異更顯著(p0.01,低于22.2%)；100μg/L西瑪津暴露組蝌蚪在第80天和90 d的時間點完全變態(tài)百分?jǐn)?shù)皆分別顯著低于對照組13.5%和21.8%(p0.01)。同時,10和100μg/L西瑪津也顯著的延長了蝌蚪完全變態(tài)所需要的天數(shù)(p0.01)。西瑪津暴露各組的雌雄爪蟾肝臟重量和HSI與對照組相比無顯著差異(p0.05),但各暴露組雄性爪蟾的HSI出現(xiàn)了小于雌性的趨勢；10和100μg/L西瑪津?qū)е赂闻K組織出現(xiàn)溶解、壞死,肝臟細(xì)胞萎縮。只有0.1μg/L西瑪津顯著誘導(dǎo)了雌性爪蟾肝臟中的hsp70的表達(dá)(p0.05),肝臟組織中的vlga2.hsp90、ar、er、gr基因表達(dá)量未被顯著影響。篩選出對非洲爪蟾生殖發(fā)育影響最大的西瑪津濃度是100μg/L,且作為內(nèi)分泌干擾物西瑪津?qū)π坌苑侵拮傅挠绊懘笥诖菩?由此,選擇雄性非洲爪蟾作為分子實驗部分的動物模型。全基因組芯片結(jié)果顯示,在100 μg/L西瑪津暴露組的睪丸組織中共有1315個差異基因,其中上調(diào)基因454個,下調(diào)基因861個(FC=2且p=0.05)。芯片的原始數(shù)據(jù)已上傳到NCBI Gene Expression Omnibus,序列號為17214940；采用Q-RT-PCR方法對選取基因進(jìn)行驗證的結(jié)果與表達(dá)譜結(jié)果一致；差異表達(dá)基因的GO分析結(jié)果顯示,與生物過程相關(guān)的有188個注釋條目,與細(xì)胞組成相關(guān)的有37個注釋條目,與分子功能相關(guān)的有33個注釋條目；通過差異基因的pathway分析,本次實驗篩選出5條顯著性富集差異基因的通路,分別是精氨酸和脯氨酸代謝通路、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸代謝通路、核黃素代謝通路、細(xì)胞周期通路、色氨酸代謝通路。本研究確認(rèn)了西瑪津?qū)蓷愔腥A大蟾蜍和非洲爪蟾的發(fā)育毒性。高劑量的西瑪津增加了兩棲類的死亡率,降低了GSI,對性腺和肝臟的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷,延遲或抑制了兩棲類的變態(tài),從兩種兩棲動物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)比較來看,中華大蟾蜍對西瑪津更加敏感；西瑪津?qū)Ψ侵拮父闻K組織基因表達(dá)的無影響,可能是由于長期暴露導(dǎo)致機(jī)體的調(diào)節(jié)適應(yīng),抑或與肝細(xì)胞損傷有關(guān)；詳細(xì)研究了與非洲爪蟾生理學(xué)和毒理學(xué)終點改變相關(guān)聯(lián)的分子水平的變化。差異基因分析結(jié)果暗示,西瑪津?qū)π坌苑侵拮覆皇峭ㄟ^誘導(dǎo)芳化酶表達(dá)實現(xiàn)雌激素效應(yīng)的。同時,也未干擾雌激素受體和雄激素受體信號通路。生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中的差異基因42Sp50,Zpax,wees,acps,ptgs2,th,stc1與西瑪津?qū)е碌男坌苑侵拮傅纳扯拘孕?yīng)密切相關(guān)。綜合分析推測,西瑪津主要通過干擾與類固醇分泌相關(guān)的基因的表達(dá),從而引起身體的組織發(fā)育和生理功能異常。西瑪津?qū)π坌苑侵拮傅亩拘宰饔媚Ｊ胶苡锌赡苁且环N綜合的新陳代謝調(diào)節(jié)模式。總之,本研究確認(rèn)了西瑪津?qū)Ρ镜胤N中華大蟾蜍和模式動物非洲爪蟾的發(fā)育影響,以及參與雄性非洲爪蟾生殖系統(tǒng)生理學(xué)和毒理學(xué)終點改變的眾多基因和信號通路,為進(jìn)一步研究西瑪津生殖毒性的分子作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持。使我們能夠通過西瑪津?qū)蓷惿嘲l(fā)育的影響,預(yù)知和推測其對人類生殖發(fā)育的危害。對制定西瑪津在我國環(huán)境中殘留的安全標(biāo)準(zhǔn)、建立環(huán)境監(jiān)測方法和發(fā)育毒性的預(yù)防策略都有著很高的科學(xué)參考價值,最終為建立和完善具有中國特色,并與國際接軌的環(huán)境雌激素安全標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)體系和數(shù)據(jù)庫奠定堅實的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：除草劑 生殖系統(tǒng) 內(nèi)分泌系統(tǒng) 基因芯片 兩棲類
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S481
【目錄】：

• 中文摘要12-17
• ABSTRACT17-23
• 符號說明及縮寫詞23-25
• 第一章 文獻(xiàn)綜述25-41
• 1.1 內(nèi)分泌干擾物質(zhì)概述25-31
• 1.1.1 內(nèi)分泌干擾物的基本性質(zhì)25-26
• 1.1.2 內(nèi)分泌干擾物的危害性26-29
• 1.1.2.1 健康危害27-28
• 1.1.2.2 生態(tài)危害28-29
• 1.1.3 內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的毒理學(xué)研究29-31
• 1.2 西瑪津的研究概況31-33
• 1.2.1 西瑪津的基本性質(zhì)31-32
• 1.2.2 西瑪津的毒理學(xué)研究概況32-33
• 1.3 分子毒理學(xué)的研究概況33-36
• 1.3.1 分子毒理學(xué)研究的熱點34-35
• 1.3.2 分子生物標(biāo)志物及其應(yīng)用的研究35
• 1.3.3 細(xì)胞與分子生物學(xué)新技術(shù)在毒理學(xué)的應(yīng)用35
• 1.3.4 分子毒理學(xué)的未來35-36
• 1.4 兩棲類在內(nèi)分泌干擾物領(lǐng)域的研究背景36-40
• 1.4.1 內(nèi)分泌干擾物對兩棲類生殖系統(tǒng)的影響36-38
• 1.4.1.1 雌雄同體的產(chǎn)生37
• 1.4.1.1 雌雄同體的產(chǎn)生37-38
• 1.4.2 內(nèi)分泌干擾物對兩棲類變態(tài)的影響38-39
• 1.4.3 內(nèi)分泌干擾物對兩棲類其他方面的影響39-40
• 1.5 本課題開展思路及研究內(nèi)容40-41
• 第二章 西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍發(fā)育的影響41-52
• 2.1 引言41-42
• 2.2 實驗材料與儀器試劑42
• 2.2.1 主要試劑42
• 2.2.2 實驗儀器42
• 2.2.3 實驗動物42
• 2.3 實驗方法42-44
• 2.3.1 實驗動物中華大蟾蜍的飼養(yǎng)和管理42
• 2.3.2 暴露實驗42-43
• 2.3.3 一般生長指標(biāo)觀察43
• 2.3.4 組織切片樣本的制備43
• 2.3.5 性腺組織切片的制備43
• 2.3.6 生長發(fā)育的主要評價指標(biāo)43-44
• 2.3.7 統(tǒng)計方法44
• 2.4 結(jié)果與分析44-50
• 2.4.1 西瑪津的實際檢測濃度44-45
• 2.4.2 中華大蟾蜍的死亡率45
• 2.4.3 西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍體重、體長和尾長的影響45-46
• 2.4.4 西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍變態(tài)發(fā)育的影響46-48
• 2.4.5 西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍性腺發(fā)育的影響48-50
• 2.4.5.1 中華大蟾蜍的性腺組織學(xué)觀察48-50
• 2.4.5.2 西瑪津?qū)χ腥A大蟾蜍性別比例和性腺形態(tài)的影響50
• 2.5 本章小結(jié)50-52
• 第三章 西瑪津?qū)Ψ侵拮干L發(fā)育和肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響52-70
• 3.1 引言52-54
• 3.1.1 評價內(nèi)分泌干擾作用的非洲爪蟾模型52
• 3.1.2 非洲爪蟾應(yīng)用于污染物發(fā)育毒性的研究52-54
• 3.1.3 非洲爪蟾的性腺組織形態(tài)54
• 3.2 實驗材料和儀器設(shè)備54-55
• 3.2.1 主要試劑54-55
• 3.2.2 實驗儀器55
• 3.2.3 實驗動物55
• 3.3 實驗方法55-59
• 3.3.1 實驗動物非洲爪蟾的飼養(yǎng)和管理56
• 3.3.2 暴露實驗設(shè)計56-57
• 3.3.3 一般生長指標(biāo)觀察57
• 3.3.4 組織切片樣本的制備57
• 3.3.5 組織切片的制備57
• 3.3.6 生長發(fā)育的主要評價指標(biāo)57-58
• 3.3.7 肝臟組織RNA的提取58
• 3.3.8 cDNA的合成58
• 3.3.9 引物設(shè)計58
• 3.3.10 Q-RT-PCR反應(yīng)58-59
• 3.3.11 統(tǒng)計方法59
• 3.4 結(jié)果與分析59-68
• 3.4.1 西瑪津的實際檢測濃度59
• 3.4.2 非洲爪蟾的死亡率59
• 3.4.3 非洲爪蟾的一般生長指標(biāo)59-61
• 3.4.4 西瑪津?qū)Ψ侵拮感韵侔l(fā)育的影響61-63
• 3.4.4.1 非洲爪蟾的性腺系數(shù)61
• 3.4.4.2 非洲爪蟾的性腺組織學(xué)觀察61-63
• 3.4.4.3 非洲爪蟾的性腺形態(tài)和性別比例63
• 3.4.5 非洲爪蟾蝌蚪的變態(tài)率和變態(tài)時間63-64
• 3.4.6 西瑪津?qū)Ψ侵拮父闻K發(fā)育的影響64-66
• 3.4.6.1 非洲爪蟾的肝臟系數(shù)64-65
• 3.4.6.2 非洲爪蟾的肝臟組織學(xué)觀察65-66
• 3.4.7 西瑪津?qū)Ψ侵拮父闻K基因表達(dá)的影響66-68
• 3.5 本章小結(jié)68-70
• 第四章 西瑪津?qū)Ψ侵拮覆G丸組織雜交微陣列芯片表達(dá)譜的影響70-91
• 4.1 引言70-71
• 4.2 實驗材料和儀器設(shè)備71-72
• 4.2.1 芯片組織樣本71
• 4.2.2 雜交微陣列芯片71
• 4.2.3 主要試劑71-72
• 4.2.4 主要儀器72
• 4.2.5 生物信息學(xué)網(wǎng)站及分析軟件72
• 4.3 實驗方法72-74
• 4.3.1 性腺組織RNA提取72
• 4.3.2 探針制備及雜交72
• 4.3.3 RT-PCR驗證基因芯片結(jié)果72-74
• 4.3.4 數(shù)據(jù)分析74
• 4.4 結(jié)果與分析74-89
• 4.4.1 雜交微陣列芯片掃描圖75
• 4.4.2 雜交微陣列芯片散點圖75-76
• 4.4.3 雜交微陣列芯片結(jié)果76-80
• 4.4.4 雜交微陣列芯片聚類分析圖80
• 4.4.5 雜交微陣列芯片結(jié)果的RT-PCR驗證80-82
• 4.4.6 差異基因的Gene Ontology分析結(jié)果82-85
• 4.4.7 差異基因的Pathway分析結(jié)果85-89
• 4.5 本章小結(jié)89-91
• 總結(jié)與展望91-93
• 附錄1 雜交微陣列芯片表達(dá)譜改變的詳細(xì)信息93-152
• 附錄2 GO分析差異表達(dá)基因的詳細(xì)結(jié)果152-168
• 參考文獻(xiàn)168-185
• 致謝185-186
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文186-187
• 附件187-199

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 余霖霖;楊靈;李軼女;周慶祥;朱越雄;沈桂芳;;高溫酸性磷酸酶acp基因的克隆、表達(dá)和功能的初步鑒定[J];生物技術(shù)通報;2007年02期

  本文關(guān)鍵詞：西瑪津?qū)蓷惏l(fā)育影響的分子生物學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：407014