本文關鍵詞：黃牛肌肉生長發(fā)育相關基因甲基化鑒定及IGF2和ZBED6基因的轉錄調控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：我國地方黃牛具有獨特的基因資源，如何從遺傳學和表觀遺傳學的角度來闡釋肉用性狀形成的原因及其分子調控機制，將成為我國黃牛遺傳改良工作的研究重點。本研究以中國黃牛作為研究對象，利用甲基化DNA免疫共沉淀測序（MeDIP-Seq）、亞硫酸氫鹽測序PCR（BSP）、結合重亞硫酸鹽處理和酶切分析（COBRA）、實時熒光定量PCR（QPCR）、蛋白質免疫印跡（Western blot）、DNA池測序、Forced-PCR-RFLP、基因克隆、細胞培養(yǎng)、腺病毒的包裝以及真核表達等現(xiàn)代生物技術進行了兩個方面的試驗研究：第一，研究了秦川牛胎牛和成年時期的背部肌肉組織的全基因組DNA甲基化修飾圖譜，篩選出甲基化和表達差異顯著的基因及其作用的信號通路；第二，研究了與肌肉生長發(fā)育相關基因（ZBED6及其靶基因IGF2）的遺傳變異及其對黃牛生長性狀的轉錄調控的影響，分析了其組織表達譜、啟動子活性、甲基化水平，以及在細胞水平上的表觀轉錄調控功能。 主要研究內容和結果如下： 1、黃牛肌肉生長發(fā)育相關甲基化基因的篩選及其功能鑒定 （1）MeDIP-Seq分析牛肌肉組織的全基因組甲基化圖譜：首次繪制出牛2個關鍵生長發(fā)育時期（胎牛和成年牛）肌肉組織全基因組水平的DNA甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)兩組樣品測序Reads在每條染色體的尾端富集程度高于其他區(qū)域，高甲基化區(qū)域的長度主要集中在900~1000bp，大多含有10~15個CpG，高甲基化區(qū)域在5’非翻譯區(qū)（5’UTR）和編碼區(qū)（CDS）基因元件上覆蓋度（即覆蓋堿基數(shù)與該區(qū)域堿基總數(shù)的比值）最高。 （2）樣品間各表達水平基因在基因及附近區(qū)域的甲基化修飾分布趨勢：成年牛在基因內及其上下游2kb區(qū)域的整體DNA甲基化水平高于胎牛，不同表達水平基因的DNA甲基化水平不同，基因的表達水平和其對應的DNA甲基化修飾程度呈負相關，即基因的mRNA表達水平越高，其DNA甲基化水平越低，反之亦然。特別是基因的轉錄起始位點最為明顯。 （3）樣品間全基因組表達差異基因和甲基化差異基因統(tǒng)計：表達水平上調基因有1,885個，下調基因有4,889個；啟動子（Promoter）區(qū)域甲基化水平上調基因有235個，下調基因有143個，該區(qū)域甲基化和表達水平負相關的基因共有77個。基因體（Genebody）區(qū)域甲基化水平上調基因有3,504個，下調基因有2,313個，該區(qū)域甲基化和表達水平負相關的基因有1054個。 （4）樣品間全基因組甲基化差異基因的GO功能顯著性富集分析：在Promoter區(qū)143個下調基因的分子功能分類中，有1項顯著富集條目，其功能都與甲基轉移酶活性相關。在基因CDS區(qū)1076個上調基因的分子功能分類中，有9項顯著富集條目，其中大部分功能都與核苷酸結合和磷酸酶調節(jié)活性相關；792個下調基因的分子功能分類中，有8項顯著富集條目，其中大部分功能都與核苷酸結合和運輸活性相關；在生物過程分類中，大部分功能都與甲基轉移酶活性相關，有1項顯著富集條目是移動。 （5）樣品間全基因組甲基化差異基因的通路（Pathway）顯著性富集分析：在Promoter區(qū)，下調基因參與的通路有93個，上調基因參與的通路有143個，均無顯著富集的通路；在CDS區(qū)，下調基因參與的通路有195個，顯著富集的通路是粘著斑，有34個下調基因顯著富集到該通路；上調基因參與的通路有209個；無顯著富集的通路。 （6）樣品間全基因組表達和甲基化負相關基因的GO功能顯著性富集分析：兩組樣品在基因Promoter和Gene body區(qū)域負相關基因都沒有顯著富集的GO項。 （7）樣品間全基因組表達和甲基化負相關基因的通路（Pathway）分析：在Promoter區(qū)，77個負相關基因參與的通路有81個，顯著性富集通路有2個，分別是檸檬酸循環(huán)和軸突導向。在Gene body區(qū)，1054個負相關基因參與的通路有204個，顯著性富集通路有3個，分別是緊密連接，調節(jié)肌動蛋白細胞骨架和維生素的消化和吸收。 （8）樣品間全基因組啟動子區(qū)表達和甲基化負相關基因的定量驗證分析：利用QPCR技術在秦川牛3個不同發(fā)育時期9種不同組織中，，對啟動子區(qū)負相關的48個基因進行了表達譜分析，其中有45個基因的定量驗證結果和甲基化測序結果一致。 2、黃牛IGF2和ZBED6基因mRNA表達及其與DNA甲基化水平相關性研究 利用QPCR、BSP和COBRA分析發(fā)現(xiàn)：牛IGF2和ZBED6基因在2個發(fā)育時期6中組織中mRNA表達量和甲基化水平呈現(xiàn)負相關，以胎牛時期的表達量和甲基化水平為對照組，ZBED6在肝臟、肺臟和脾臟的mRNA表達量均有所上升，而DNA甲基化水平均有所下降；IGF2在肌肉、心臟、肺臟和脾臟的表達量均有所下降，而甲基化水平均有所上升。 3、黃牛IGF2和ZBED6基因SNPs檢測及其與生長性狀的效應分析 本研究利用DNA池測序分析結果發(fā)現(xiàn)：在IGF2基因內含子8區(qū)域發(fā)現(xiàn)4處非編碼突變，分別命名為IVS8-17GA，-220CT，-221AG和-1393AG。在ZBED6基因上游區(qū)域發(fā)現(xiàn)1處非編碼突變和編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)2處錯義突變，分別命名為-826GA，680CG和1043AG；關聯(lián)分析結果顯示：在南陽牛和郟縣紅牛群體中，不同基因型對5個關鍵生長發(fā)育時期的體重顯著相關；在秦川牛群體中，不同基因型與成年基礎母牛的10項體尺和體重指標性狀顯著相關；兩個基因的突變型個體大于野生型個體（P0.01或者P0.05）。 4、轉錄因子ZBED6對IGF2基因轉錄活性及調控特征的研究 （1）生物信息學分析結果顯示，在ZBED6基因啟動子突變型M-826A的序列上，發(fā)現(xiàn)一個新結合的轉錄因子PLZF，PLZF可能作為抑制因子參與了抑制ZBED6的轉錄活性，而參與上調動物機體的造血功能，脂肪和肌肉細胞增殖及分化過程。 （2）雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的檢測結果顯示：在啟動子-866bp到-556bp位置之間的片段活性最高，野生型M-826G-pGL3的啟動子活性顯著高于突變型。IGF2基因IVS3-3106GA突變后的3個不同長度片段的啟動子序列的活性顯著上調，其中長度為439bp啟動子截短體序列的活性最強；過表達ZBED6基因對IGF2基因的啟動子活性有極顯著的下調作用。 （3）QPCR分析結果顯示：ZBED6基因編碼區(qū)發(fā)生突變的單倍型個體在秦川牛肌肉組織中的mRNA表達量顯著下降，IGF2基因mRNA表達量顯著上升。在體外培養(yǎng)的C2C12細胞中，過表達ZBED6可引起IGF2基因mRNA表達量顯著上升。 以上結果可知，轉錄因子ZBED6可與IGF2基因內含子3區(qū)域突變位點（3106A）附近的序列結合來發(fā)揮其對IGF2基因轉錄活性的抑制調控功能。 5、抑制因子ZBED6基因腺病毒干擾載體的構建及其功能研究 篩選出具有明顯干擾效果的shRNA（pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-906）并進行了病毒重組和包裝；重組的腺病毒干擾載體感染牛原代肌肉細胞，QPCR、半定量PCR和Western blot的檢測結果顯示，ZBED6表達量下調，IGF2基因表達量明顯上調，揭示了干擾轉錄因子ZBED6，可失去其對IGF2基因的抑制作用。 6、抑制因子ZBED6基因腺病毒過表達載體的構建及其功能研究 構建了牛Ad-ZBED6重組腺病毒超表達載體；包裝和擴繁得到高滴度的超表達腺病毒；重組的過表達腺病毒Ad-ZBED6感染牛原代肌肉細胞，QPCR、半定量PCR和Westernblot的檢測結果顯示，ZBED6表達量上調，IGF2基因表達量明顯下調，揭示了過表達轉錄因子ZBED6可增加其對IGF2基因的抑制作用。 以上的研究結果顯示，在黃牛不同發(fā)育時期的肌肉組織中存在大量DNA甲基化修飾和mRNA表達差異的基因，這些差異基因主要與肌肉細胞的生長分化和代謝相關；在細胞、個體和群體水平上鑒定了與肌肉生長發(fā)育相關的功能基因ZBED6及其靶基因IGF2，研究這兩個關鍵基因在轉錄前、轉錄后和翻譯過程中的相互調控作用，從而系統(tǒng)地從遺傳和表觀遺傳調控等方面揭示與肌肉生長發(fā)育相關基因的功能與分子調控機制，這不僅對全方位闡明黃牛肉用性狀遺傳和調控的分子機理具有重要科學意義，而且為黃牛肉用選育和高效生產(chǎn)提供科學理論依據(jù)。
【關鍵詞】：黃牛 肌肉 MeDIP-Seq 甲基化 ZBED6基因
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：S823.81
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-19
• 文獻綜述19-36
• 第一章 表觀遺傳學和 DNA 甲基化研究概述19-30
• 1.1 表觀遺傳學研究概述19-20
• 1.1.1 表觀遺傳學與表觀遺傳19
• 1.1.2 表觀遺傳學的研究內容及其特點19-20
• 1.2 表觀遺傳學所涉及的主要機制20-24
• 1.2.1 DNA 甲基化20-21
• 1.2.2 非編碼 RNA 調控!21-23
• 1.2.3 組蛋白修飾23-24
• 1.2.4 染色質重塑24
• 1.3 DNA 甲基化抑制基因表達的機制24-25
• 1.4 DNA 甲基化的生物學功能25-26
• 1.4.1 維持基因組穩(wěn)定25
• 1.4.2 調控基因表達25
• 1.4.3 參與其它表觀遺傳學修飾25
• 1.4.4 調節(jié)動物生長發(fā)育25
• 1.4.5 影響雜種優(yōu)勢25-26
• 1.4.6 影響老化26
• 1.5 DNA 甲基化的檢測方法26-29
• 1.5.1 DNA 甲基化與 CpG 島26
• 1.5.2 全基因組甲基化模式（pattern）與甲基化譜（profiling）分析26-27
• 1.5.3 候選基因特異位點甲基化水平分析27-29
• 1.6 小結29-30
• 第二章 印跡基因 IGF2 和轉錄因子 ZBED6 研究概述30-36
• 2.1 IGF2 基因的研究概述30-31
• 2.1.1 IGFs 系統(tǒng)的組成及其生物學功能30
• 2.1.2 IGF2 基因的印跡調控現(xiàn)象30-31
• 2.1.3 IGF2 基因與肌肉生長發(fā)育的關系31
• 2.2 ZBED6 基因的研究概述31-35
• 2.2.1 鋅指蛋白的結構與功能31-32
• 2.2.2 ZBED 基因家族成員概述32-33
• 2.2.3 ZBED6 基因的發(fā)現(xiàn)33-35
• 2.2.4 ZBED6 基因的功能35
• 2.3 小結35-36
• 實驗研究36-174
• 第三章 黃牛肌肉生長發(fā)育相關甲基化基因的篩選及其功能鑒定36-89
• 3.1 材料與方法37-41
• 3.1.1 試驗動物37
• 3.1.2 樣品采集37
• 3.1.3 RNA 的提取、檢測和 cDNA 合成37
• 3.1.4 DNA 的提取與檢測37-38
• 3.1.5 實時定量 PCR（QPCR）分析38-39
• 3.1.6 MeDIP-Seq 文庫制備流程39-40
• 3.1.7 MeDIP-Seq 信息分析流程40-41
• 3.2 MeDIP-Seq 高通量信息分析41-44
• 3.2.1 MeDIP-Seq 數(shù)據(jù)處理41-42
• 3.2.2 MeDIP-Seq 序列與參考序列的比對42
• 3.2.3 MeDIP-Seq 數(shù)據(jù)的全基因組分布趨勢42
• 3.2.4 MeDIP-Seq 數(shù)據(jù)高甲基化富集區(qū)域（Peak）分析42-43
• 3.2.5 基于高甲基化富集區(qū)域（Peak）的兩個樣品間差異性分析43-44
• 3.3 MeDIP-Seq 和 RNA-Seq 的聯(lián)合分析44-46
• 3.3.1 Reads 在基因組上的比對情況及分布44
• 3.3.2 全基因組水平上基因表達與甲基化的分布規(guī)律44-45
• 3.3.3 各表達水平基因在基因及附近區(qū)域的甲基化修飾45
• 3.3.4 各類甲基化修飾區(qū)域基因的平均表達水平45
• 3.3.5 樣品間基因甲基化修飾對表達的調控45-46
• 3.3.6 兩樣品間甲基化與表達呈負相關的基因的功能分析46
• 3.4 MeDIP-Seq 高通量測序結果與分析46-65
• 3.4.1 牛基因組 DNA 樣品的檢測46-47
• 3.4.2 MeDIP-Seq 數(shù)據(jù)處理47
• 3.4.3 MeDIP-Seq 序列與參考序列的比對47
• 3.4.4 MeDIP-Seq 測序數(shù)據(jù)全基因組分布趨勢47-53
• 3.4.5 MeDIP-Seq 數(shù)據(jù)高甲基化富集區(qū)域（Peak）分析53-58
• 3.4.6 基于高甲基化區(qū)域（Peak）的多樣品間甲基化差異性分析58-65
• 3.5 MeDIP-Seq 和 RNA-Seq 測序結果及其聯(lián)合分析65-86
• 3.5.1 Reads 在基因組上的比對情況及分布65-67
• 3.5.2 全基因組水平上基因表達與甲基化的分布規(guī)律67-69
• 3.5.3 各表達水平基因在基因及附近區(qū)域的甲基化修飾69-71
• 3.5.4 各類甲基化修飾區(qū)域基因的平均表達水平71-73
• 3.5.5 樣品間基因甲基化修飾對表達的調控73-75
• 3.5.6 兩樣品間甲基化與表達呈負相關的基因的功能分析75-78
• 3.5.7 兩樣品間啟動子區(qū)甲基化與表達呈負相關的基因的 QPCR 驗證分析78-86
• 3.6 討論86-87
• 3.7 小結87-89
• 第四章 黃牛 IGF2 和 ZBED6 基因 mRNA 表達及其與 DNA 甲基化水平相關性研究89-106
• 4.1 材料與方法89-96
• 4.1.1 試驗動物89
• 4.1.2 樣品采集89-90
• 4.1.3 RNA 的提取、檢測和 cDNA 合成90
• 4.1.4 DNA 的提取與檢測90
• 4.1.5 實時定量 PCR（QPCR）分析90
• 4.1.6 亞硫酸氫鹽測序 PCR（BSP）90-92
• 4.1.7 結合重亞硫酸鹽處理和酶切（COBRA）分析92-96
• 4.1.8 統(tǒng)計分析96
• 4.2 結果96-104
• 4.2.1 實時定量 PCR（QPCR）分析96-98
• 4.2.2 亞硫酸氫鹽測序 PCR（BSP）分析98-102
• 4.2.3 結合重亞硫酸鹽處理和酶切（COBRA）分析102-104
• 4.3 討論104-105
• 4.4 小結105-106
• 第五章 黃牛 IGF2 和 ZBED6 基因 SNPs 檢測及其與生長性狀的效應分析106-122
• 5.1 材料與方法106-109
• 5.1.1 實驗動物106-107
• 5.1.2 主要試劑107-108
• 5.1.3 候選基因 SNPs 的篩查108
• 5.1.4 資料的統(tǒng)計與分析108-109
• 5.2 結果與分析109-120
• 5.2.1 候選基因DNA池測序分析109
• 5.2.2 利用Forced PCR-RFLP檢測SNPs109-112
• 5.2.3 候選基因SNPs的群體遺傳參數(shù)分析112-113
• 5.2.4 候選基因SNPs的連鎖不平衡和單倍型分析113-116
• 5.2.5 候選基因SNPs與生長性狀的關聯(lián)分析116-119
• 5.2.6 候選基因SNPs組合基因型與生長性狀的關聯(lián)分析119-120
• 5.3 討論120-121
• 5.4 小結121-122
• 第六章 轉錄因子 ZBED6 對 IGF2 基因轉錄調控研究122-144
• 6.1 材料與方法122-133
• 6.1.1 試驗材料122-123
• 6.1.2 試驗儀器123
• 6.1.3 試劑配制123
• 6.1.4 生物信息學分析轉錄因子結合位點123
• 6.1.5 雙色熒光報告載體的構建123-129
• 6.1.6 過表達載體的構建129-131
• 6.1.7 細胞培養(yǎng)和轉染131-132
• 6.1.8 熒光素酶活性分析132
• 6.1.9 實時定量 PCR（QPCR）分析132-133
• 6.1.10 Western Blot 分析133
• 6.1.11 統(tǒng)計分析133
• 6.2 結果133-142
• 6.2.1 ZBED6 基因啟動子區(qū)域轉錄因子分析133-134
• 6.2.2 ZBED6 基因啟動子區(qū)域活性分析134-137
• 6.2.3 IGF2 基因定點突變重組體啟動子活性分析137
• 6.2.4 過表達 ZBED6 對 IGF2 啟動子活性的影響137-139
• 6.2.5 不同單倍型個體 ZBED6 和 IGF2 表達量比較139-140
• 6.2.6 ZBED6 對 IGF2 轉錄調控的影響140-142
• 6.3 討論142-143
• 6.4 小結143-144
• 第七章 ZBED6 基因腺病毒干擾載體的構建及其功能研究144-161
• 7.1 材料與方法144-153
• 7.1.1 試驗材料144-145
• 7.1.2 試驗儀器145
• 7.1.3 pDsRed1-N1-ZBED6 表達載體的構建145-148
• 7.1.4 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 載體的構建148-151
• 7.1.5 有效 shRNA 序列的篩選151
• 7.1.6 重組 ZBED6-shRNA 腺病毒載體構建與鑒定151-152
• 7.1.7 重組 shRNA 腺病毒包裝、擴增及滴度測定152
• 7.1.8 重組 shRNA 腺病毒的滴度測定152
• 7.1.9 最佳感染強度的確定152-153
• 7.1.10 牛原代肌肉細胞的培養(yǎng)153
• 7.1.11 重組 shRNA 腺病毒干擾效果研究153
• 7.2 結果與分析153-160
• 7.2.1 pDsRed1-N1-ZBED6 載體的構建153
• 7.2.2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 載體的構建153-155
• 7.2.3 有效 shRNA 的篩選155-156
• 7.2.4 重組 shRNA 腺病毒載體的包裝及擴增156-157
• 7.2.5 重組 shRNA 腺病毒滴度測定157-158
• 7.2.6 最佳感染強度的確定158
• 7.2.7 重組 shRNA 腺病毒載體的干擾效率158
• 7.2.8 重組 shRNA 腺病毒載體干擾效果研究158-160
• 7.3 討論160
• 7.4 小結160-161
• 第八章 ZBED6 基因腺病毒過表達載體的構建及其功能研究161-172
• 8.1 材料與方法161-166
• 8.1.1 試驗材料161-162
• 8.1.2 試驗儀器162
• 8.1.3 腺病毒穿梭載體 pAdTrack/CMV-ZBED6 構建162-164
• 8.1.4 腺病毒穿梭載體 Pme I 線性化164
• 8.1.5 腺病毒穿梭載體與骨架載體 pAdEasy-1 的重組164-166
• 8.1.6 重組腺病毒 Ad-ZBED6 的包裝與擴增166
• 8.1.7 重組腺病毒 Ad-ZBED6 滴度測定166
• 8.1.8 最佳感染強度的確定166
• 8.1.9 重組腺病毒 Ad-ZBED6 的功能研究166
• 8.2 結果與分析166-171
• 8.2.1 穿梭載體 pAdTrack/CMV-ZBED6 的構建166
• 8.2.2 重組質粒 Ad-ZBED6 的 Pac I 酶切鑒定166-167
• 8.2.3 腺病毒載體 Ad-ZBED6 的包裝及擴增167-168
• 8.2.4 重組過表達腺病毒滴度測定168-169
• 8.2.5 最佳感染強度的確定169
• 8.2.6 重組腺病毒 Ad-ZBED6 的超表達效率169
• 8.2.7 重組腺病毒 Ad-ZBED6 的功能研究169-171
• 8.3 討論171
• 8.4 小結171-172
• 第九章 結論與創(chuàng)新點172-174
• 9.1 結論172-173
• 9.2 創(chuàng)新點173-174
• 參考文獻174-187
• 附錄（第三章）187-228
• 附錄（第四章）228-230
• 附錄（第五章）230-256
• 附錄（第六章）256-281
• 附錄（第七章）281-287
• 縮略詞287-289
• 致謝289-290
• 個人簡介290-293

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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  本文關鍵詞：黃牛肌肉生長發(fā)育相關基因甲基化鑒定及IGF2和ZBED6基因的轉錄調控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：369731