發(fā)布時(shí)間：2017-05-12 00:03

  本文關(guān)鍵詞：桑樹MAPK基因家族信息分析與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生物和非生物逆境脅迫因子(如病原侵害、干旱、高鹽和高低溫等)嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育以及產(chǎn)量和品質(zhì)。植物對(duì)脅迫應(yīng)答響應(yīng)是一個(gè)涉及基因、信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及基因表達(dá)產(chǎn)物協(xié)同參與的過(guò)程,這個(gè)過(guò)程又分為到4個(gè)階段：植物對(duì)脅迫信號(hào)的感知、脅迫信號(hào)的傳遞、膜受體對(duì)脅迫信號(hào)的識(shí)別與傳導(dǎo)和相關(guān)抗逆基因的表達(dá)。在這其中,蛋白激酶是植物體內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)酶,通過(guò)膜受體感知外界環(huán)境脅迫信號(hào),引起細(xì)胞內(nèi)一些離子和分子濃度改變,激活不同蛋白磷酸化途徑。而促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),它是普遍存在于真核生物中的一類保守的絲氨酸／蘇氨酸類蛋白激酶,在植物生長(zhǎng)發(fā)育和多種生物、非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。 桑樹是一種對(duì)環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性的多年生生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種,具有耐鹽堿、耐旱、耐澇和耐寒等多種特性。但其逆境生理、生化和分子生物學(xué)研究極少。關(guān)于桑樹抗性的研究主要集中在抗性種子資源的篩選及抗性生理指標(biāo)的測(cè)定,桑樹抗性基因的研究并不多見。雖然MAPK在一些植物中已經(jīng)被鑒定并驗(yàn)證功能,但是在公共數(shù)據(jù)庫(kù)(如NCBI, EMBL等)中沒(méi)有桑樹MAPK的相關(guān)報(bào)道。隨著川�；蚪M的完成,使在全基因組水平分析桑樹MAPK抗性基因家族成為可能,這對(duì)于探明MAPK脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)理以及植物對(duì)生物和非生物脅迫適應(yīng)機(jī)制具有重要意義,為桑樹分子改良提供研究基礎(chǔ)。 本研究基于川�；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù),利用生物信息學(xué)方法對(duì)預(yù)測(cè)的桑樹MAPK基因家族根據(jù)其氨基酸序列和保守基序進(jìn)行分類和系統(tǒng)發(fā)生分析,從中鑒定出47個(gè)桑樹MAPK (MnMAPK)家族基因：32個(gè)MnMAPKKK5個(gè)MnMAPKK和10個(gè)MnMAPK基因。并對(duì)其中的10個(gè)MnMAPK基因的基因結(jié)構(gòu)、上游啟動(dòng)子保守元件、氨基酸保守序列及與其他植物中MAPK蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；并對(duì)其克隆序列與川�；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析；以生長(zhǎng)2個(gè)月(高度約25cm)的湖桑幼苗為材料,對(duì)其進(jìn)行不同的脅迫(高溫,低溫,高鹽和干旱)和信號(hào)分子(ABA, SA, H2O2和MeJA)處理,通過(guò)qRT-PCR分析桑樹MAPK基因在不同脅迫誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況；基于脅迫誘導(dǎo)表達(dá)譜篩選出候選的MnMAPK6基因進(jìn)行啞細(xì)胞定位,構(gòu)建植物超量表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行高溫,干旱,高鹽,H202等處理,觀察其對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的塵長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫耐受情況。本研究的主要研究結(jié)果如下： 1、川桑MAPK基因家族生物信息學(xué)分析和克隆 利用生物信息學(xué)方法在川�；蚪M中鑒定得到47個(gè)桑樹MAPKs家族基因：32個(gè)MnMAPKKK.5個(gè)MnMAPKK和10個(gè)MnMAPK基因。并對(duì)其中的10個(gè)MnMAPK基因的基因結(jié)構(gòu)、上游啟動(dòng)子保守元件、氨基酸保守序列及與其他植物由MAPK蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,克隆了10個(gè)MnMAPK基因,序列驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)川�；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)中MnMAPK2比川桑cDNA中克隆得到的MnMAPK2全長(zhǎng)cDNA缺失15個(gè)核苷酸堿基,MnMAPK8存在兩種剪接形式。MnMAPK基因CDS大小介于1107bp到1902bp之間,它們編碼的蛋白質(zhì)大小范圍為368至633個(gè)氨基酸(aa),預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量在42.4kD和70.9kD的之間,等電點(diǎn)大小介于5.0到9.28之間。通過(guò)桑樹MAPK氨基酸序列多重序列比與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),桑樹MAPK分布在A-E組。 2、桑樹MAPK基因非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析 對(duì)川桑MAPK家族的10個(gè)基因設(shè)計(jì)qRT-PCR引物,以生長(zhǎng)兩個(gè)月的湖桑32號(hào)幼苗為材料,進(jìn)行高溫、低溫、干旱、高鹽非生物脅迫處理和ABA.SA.H2O2和MeJA四種信號(hào)分子處理,提取對(duì)照組和處理組材料的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,檢測(cè)桑樹MAPK基因在脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明,桑樹MnMAPKs基因可以受到多種非生物脅迫的誘導(dǎo),不同的桑樹MAPK基因?qū)Σ煌拿{迫處理有不同的脅迫應(yīng)答模式。 3、川桑MnMAPK6基因亞細(xì)胞定位與功能研究 MnMAPK6在桑樹根、莖和葉三個(gè)組織在不同的非生物脅迫和不同的時(shí)間段處理后的表達(dá)模式不同,可以響應(yīng)多種脅迫,暗示MnMAPK6參與了桑樹非生物脅迫響應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 構(gòu)建35S-MnMAPK6::EGFP瞬時(shí)表達(dá)載體,同時(shí)構(gòu)建35S-EGFP表達(dá)載體作為對(duì)照,用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,結(jié)果顯示MnMAPK6融合蛋白被定位在細(xì)胞核中。 構(gòu)建MnMAPK6植物超量表達(dá)載體,浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥并獲得轉(zhuǎn)基因植株。不同的過(guò)表達(dá)植株GUS的表達(dá)量不同,并且表現(xiàn)出一定的組織差異性,其中OE6株系中GUS的表達(dá)量最高,OEl株系中GUS的表達(dá)量最低,MnMAPK6在獲得的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量也不相同,轉(zhuǎn)基因株系OE6的MnMAPK6表達(dá)量最高,OE5和OE3次之,OE1的表達(dá)量最低。選取OE6,OE5和OEl這三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系來(lái)研究轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)脅迫刺激的耐受情況。結(jié)果顯示,與野生型擬南芥相比,過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)高鹽和H202的耐受性提高,而對(duì)高溫和干旱敏感。
【關(guān)鍵詞】：桑樹 MAPK 非生物脅迫 表達(dá)分析 亞細(xì)胞定位 轉(zhuǎn)基因擬南芥
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：S888
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-20
• 1.1 植物非生物脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)14
• 1.2 蛋白激酶與信號(hào)傳導(dǎo)14-15
• 1.3 植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑15-17
• 1.4 植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑的功能17-20
• 1.4.1 MAPK與植物激素信號(hào)傳遞18
• 1.4.2 MAPK與干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫信號(hào)傳遞18-19
• 1.4.3 MAPK與植物病原信號(hào)傳遞19
• 1.4.4 桑樹抗性基因相關(guān)研究19-20
• 第二章 引言20-24
• 2.1 研究背景及意義20
• 2.2 主要研究?jī)?nèi)容20-22
• 2.3 技術(shù)路線22-24
• 第三章 川桑MAPK基因家族生物信息學(xué)分析和克隆24-40
• 3.1 材料和試劑24-26
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料24
• 3.1.2 主要試劑24
• 3.1.3 主要試劑和緩沖液配方24-25
• 3.1.4 主要儀器25-26
• 3.2 方法26-31
• 3.2.1 川桑MAPK家族蛋白序列的獲得26
• 3.2.2 RNA的提取與檢測(cè)26-27
• 3.2.3 第一鏈cDNA的合成27-28
• 3.2.4 川桑MAPK基因家族的克隆與序列鑒定28-31
• 3.2.5 川桑MAPK基因家族的保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析31
• 3.3 結(jié)果與分析31-38
• 3.3.1 川桑MAPK家族基因的分離與克隆鑒定31-36
• 3.3.2 MnMAPK系統(tǒng)發(fā)育樹和結(jié)構(gòu)域分析36-38
• 3.4 小結(jié)與討論38-40
• 第四章 桑樹MAPK基因非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析40-48
• 4.1 材料和試劑儀器40-41
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 4.1.2 主要試劑40
• 4.1.3 主要儀器40-41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-42
• 4.2.1 桑樹幼苗的培養(yǎng)和脅迫處理41
• 4.2.2 RNA的提取與檢測(cè)41
• 4.2.3 cDNA第一鏈的合成41
• 4.2.4 桑樹MAPK基因定量引物設(shè)計(jì)41-42
• 4.2.5 桑樹MAPK基因熒光定量PCR(qRT-PCR)42
• 4.3 結(jié)果與分析42-46
• 4.3.1 桑樹MAPK基因脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析42-46
• 4.4 小結(jié)與討論46-48
• 第五章 川桑MnMAPK6基因亞細(xì)胞定位與遺傳轉(zhuǎn)化48-76
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑48-52
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 5.1.2 主要試劑48-49
• 5.1.3 主要試劑和緩沖液配方49-52
• 5.1.4 主要儀器52
• 5.2 方法52-62
• 5.2.1 桑樹幼苗的培養(yǎng)和脅迫誘導(dǎo)處理52-53
• 5.2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化53
• 5.2.3 MnMAPK6亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建洋蔥表皮亞細(xì)胞定位53-56
• 5.2.4 洋蔥表皮亞細(xì)胞定位瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化56-57
• 5.2.5 植物超量表達(dá)載體的構(gòu)建57-58
• 5.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥58-59
• 5.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定59-61
• 5.2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥非生物脅迫處理61-62
• 5.3 結(jié)果與分析62-74
• 5.3.1 MnMAPK6在桑樹中的脅迫表達(dá)分析62-65
• 5.3.2 MnMAPK6亞細(xì)胞定位65
• 5.3.3 MnMAPK6植物轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建65-66
• 5.3.4 MnMAPK6轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得與鑒定66-68
• 5.3.5 MnMAPK6轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)情況68-74
• 5.4 小結(jié)與討論74-76
• 第六章 綜合與討論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-84
• 附錄84-86
• 在讀期間發(fā)表論文及參研課題86-88
• 致謝88

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：358328