磷是植物生長發(fā)育不可缺少的大量營養(yǎng)元素之一。然而土壤有效磷濃度很低,遠不能滿足植物獲取充足磷營養(yǎng)的需求。玉米是重要的糧食、飼料和能源作物。土壤有效磷不足是限制玉米產(chǎn)量的重要因素。向土壤中大量施加磷肥能減少有效磷不足造成的產(chǎn)量損失,但是磷肥投入不僅大大增加生產(chǎn)成本,而且嚴重污染環(huán)境。因此深入研究玉米耐低磷機制,發(fā)展耐低磷玉米品種,增加玉米在低磷條件下的產(chǎn)量,地農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟和環(huán)境都有重要的意義。轉(zhuǎn)TsVP提高玉米低磷耐受性的研究通過植物基因工程的手段將有價值的基因轉(zhuǎn)入玉米是發(fā)展耐低磷玉米品種的重要途徑。許多研究表明超表達氫離子焦磷酸酶（H+-PPase）基因能夠在多種植物中促進植物根系生長發(fā)育并能提高植物的抗逆性。在高等植物中,根系是植物吸收礦質(zhì)營養(yǎng)的主要器官,尤其磷素在土壤中的移動性很低,所以根系的生長發(fā)育和形態(tài)結(jié)構(gòu)對捕獲吸收土壤磷素和提高植物耐低磷能力尤為重要。因此為了探索H+-PPase能否提高玉米的耐低磷能力,本工作中我們選用玉米自交系DH4866以及其轉(zhuǎn)鹽芥H+-PPase基因（TsVP）玉米為實驗材料,比較兩者的耐低磷能力以及在低磷條件下的產(chǎn)量,以期得到耐低磷能力提高的轉(zhuǎn)基因玉米... 

【文章來源】：山東大學山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號說明
第一部分 前言
    1.1 土壤磷資源現(xiàn)狀
    1.2 磷對植物生長發(fā)育的作用
    1.3 植物低磷響應(yīng)的生理生化機制
        1.3.1 磷動員和吸收能力的提高
            1.3.1.1 外泌有機酸和質(zhì)子
            1.3.1.2 酸性磷酸酶合成增加
            1.3.1.3 磷吸收能力的提高
        1.3.2 植物體內(nèi)磷分配的改變
        1.3.3 代謝反應(yīng)的調(diào)整
        1.3.4 根系形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化
    1.4 植物低磷響應(yīng)的分子機制
        1.4.1 植物磷吸收相關(guān)基因及調(diào)控
        1.4.2 植物體內(nèi)磷分配相關(guān)基因及調(diào)控
        1.4.3 有機酸和酸性磷酸酶合成和分泌相關(guān)基因及調(diào)控
        1.4.4 植物根系形態(tài)結(jié)構(gòu)的調(diào)控
        1.4.5 植物低磷反應(yīng)的基因表達調(diào)控
        1.4.6 植物低磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究進展
            1.4.6.1 以PHR1為中心的低磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.4.6.2 與SPX結(jié)構(gòu)域基因相關(guān)的低磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.4.6.3 低磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與激素等信號途徑的關(guān)系
    1.5 H~+-PPase及相關(guān)基因工程的研究進展
        1.5.1 液泡膜H~+-PPase的分子結(jié)構(gòu)與功能
            1.5.1.1 H~+-PPase的分子結(jié)構(gòu)
            1.5.1.2 H~+-PPase的主要功能
        1.5.2 H~+-PPase與植物抗逆的研究進展
    1.6 MicroRNA研究進展
        1.6.1 miRNA的生物合成
            1.6.1.1 miRNA的轉(zhuǎn)錄
            1.6.1.2 miRNA加工運輸
            1.6.1.3 miRNA進入沉默復(fù)合體
        1.6.2 miRNA的作用方式
            1.6.2.1 miRNA對靶基因的剪切
            1.6.2.2 miRNA對靶基因的翻譯抑制作用
        1.6.3 miRNA在植物體中的功能
            1.6.3.1 miRNA參與花器官發(fā)育
            1.6.3.2 miRNA參與葉片發(fā)育
            1.6.3.3 miRNA參與植物低磷響應(yīng)過程
    1.7 本研究的目的及意義
第二部分 轉(zhuǎn)TsVP提高玉米低磷耐受性的研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 轉(zhuǎn)基因玉米T2代純合株系的分子生物學檢測
            2.1.2.1 PCR檢測
            2.1.2.2 半定量RT-PCR
            2.1.2.3 Southern雜交檢測
        2.1.3 植物材料培養(yǎng)
        2.1.4 TsVP基因表達強度的檢測
            2.1.4.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
            2.1.4.2 Real time PCR反應(yīng)
        2.1.5 液泡膜H-PPase活性的測定
            2.1.5.1 液泡膜的分離
            2.1.5.2 液泡膜H-PPase活性測定
        2.1.6 植株生物量和磷含量的測定
        2.1.7 磷吸收動力學參數(shù)的測定
        2.1.8 根系形態(tài)參數(shù)的測定
        2.1.9 酸性磷酸酶活性測定
            2.1.9.1 細胞內(nèi)酸性磷酸酶活性測定
            2.1.9.2 分泌型酸性磷酸酶活性測定
        2.1.10 根系有機酸分泌速率測定
        2.1.11 玉米根際pH值測定
        2.1.12 質(zhì)膜ATPase活性檢測
        2.1.13 可溶性糖測定
        2.1.14 IAA含量測定
        2.1.15 生長素運輸相關(guān)基因表達測定
        2.1.16 土壤培養(yǎng)實驗
        2.1.17 光合作用和葉綠素熒光參數(shù)測定
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 轉(zhuǎn)TsVP玉米T2代純合株系的分子生物學檢測
        2.2.2 轉(zhuǎn)基因玉米有較高的液泡膜H-PPase活性
        2.2.3 低磷脅迫對玉米生長的影響
        2.2.4 轉(zhuǎn)基因玉米有較發(fā)達的根系系統(tǒng)
        2.2.5 轉(zhuǎn)基因玉米有較高的磷吸收的速率
        2.2.6 轉(zhuǎn)基因玉米積累較多的磷
        2.2.7 轉(zhuǎn)基因玉米有較強的根際酸化能力
        2.2.8 玉米酸性磷酸酶分析
        2.2.9 玉米可溶性糖含量分析
        2.2.10 玉米生長素含量分析
        2.2.11 玉米生長素運輸相關(guān)基因表達分析
        2.2.12 外源施加IAA和NPA對非轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因玉米根系的影響
        2.2.13 玉米在低磷土壤中的生長發(fā)育狀況
            2.2.13.1 長期低磷脅迫對玉米生長發(fā)育的影響
            2.2.13.2 低磷脅迫對玉米光合作用的影響
            2.2.13.3 低磷脅迫對玉米雌雄穗發(fā)育的影響
            2.2.13.4 低磷脅迫對玉米廣量的影響
    2.3 討論
第三部分 不同供磷水平下耐低磷玉米自交系99038和來源親本Qi319microRNA的差異分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 植物材料和培養(yǎng)
        3.1.2 植株生物量、磷含量和根系形態(tài)參數(shù)的測定
        3.1.3 小RNA文庫構(gòu)建和測序
        3.1.4 測序數(shù)據(jù)分析和miRNA鑒定
        3.1.5 靶基因鑒定
        3.1.6 覽定文庫間差異表達的miRNA
        3.1.7 通過real-time PCR分析miRNA表達水平
            3.1.7.1 玉米small RNA提取
            3.1.7.2 Small RNA 反轉(zhuǎn)錄
            3.1.7.3 Real time PCR
        3.1.8 通過real-time PCR分析靶基因表達水平
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 低磷脅迫對Qi319和99038生長的影響
        3.2.2 玉米小RNA高通量測序數(shù)據(jù)分析
        3.2.3 玉米小RNA長度分布
        3.2.4 玉米小RNA分類
        3.2.5 玉米已知miRNA鑒定
        3.2.6 玉米novel miRNA鑒定
        3.2.7 玉米miRNA靶基因鑒定
        3.2.8 不同供磷水平下Qi319和99038間差異表達的miRNA
        3.2.9 玉米低磷響應(yīng)miRNA
        3.2.10 通過real-time PCR確認miRNA農(nóng)達水平
        3.2.11 miRNA及其靶基因表達模式分析
    3.3 討論
第四部分 總結(jié)和展望
參考文獻
附錄3-1 本工作中鑒定到的玉米已知miRNA及表達量
附錄3-2 本工作中鑒定到的玉米novel miRNA及表達量
附錄3-3 玉米novel miRNA候選靶基因
致謝
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【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3549483