本文關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中卵丘細(xì)胞上基因表達(dá)譜變化及其生物學(xué)意義，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵泡作為卵巢的功能單位,由卵母細(xì)胞及包裹于其周?chē)念w粒細(xì)胞(granulosa cells,GCs)和外圍的膜細(xì)胞組成。卵泡生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而又精細(xì)調(diào)控的過(guò)程,期間卵母細(xì)胞逐步獲得發(fā)育潛能,為后續(xù)受精及胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備。卵泡發(fā)育過(guò)程中,隨著卵泡腔形成,顆粒細(xì)胞分化為兩種不同表型:①壁顆粒細(xì)胞(Mural granulose cells,MGCs),位于卵泡腔周?chē)?主要功能為類(lèi)固醇激素合成及促進(jìn)卵泡壁破裂;②卵丘細(xì)胞(cumulus cells,CCs),與卵母細(xì)胞緊密聯(lián)系,兩者構(gòu)成卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體(COC)。卵母細(xì)胞和CCs之間通過(guò)縫隙鏈接和旁分泌信號(hào)通路相互交流,形成卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境,并貫穿于整個(gè)卵泡發(fā)育過(guò)程。在竇前卵泡階段,卵泡生長(zhǎng)不依賴(lài)于FSH的作用,主要通過(guò)GCs上表達(dá)KIT配體(KITL),作用于卵母細(xì)胞上的受體KIT促進(jìn)卵子生長(zhǎng);反過(guò)來(lái),卵子通過(guò)旁分泌因子(oocyte secrete factors,OSFs),主要為生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)形成蛋白15(BMP15),作用于CCs促進(jìn)CCs增殖、抗凋亡。在竇卵泡階段,CCs通過(guò)縫隙連接向卵子傳遞c AMP和c GMP等小分子物質(zhì)以維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯,同時(shí)其自身也受到OSFs的調(diào)節(jié)以拮抗FSH引起的黃素化作用;在卵母細(xì)胞成熟階段,卵母細(xì)胞和CCs相互協(xié)調(diào)完成卵丘擴(kuò)張及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。此外,CCs為卵母細(xì)胞提供必須的代謝小分子如丙酮酸、丙氨酸和膽固醇以供卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,同時(shí)卵母細(xì)胞促進(jìn)了CCs三大代謝相關(guān)酶的表達(dá)。卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞這些緊密的相互作用,提示卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中在CCs上存在諸多印記,即CCs上的相關(guān)基因表達(dá)、分子和信號(hào)可以間接反應(yīng)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的狀態(tài)。卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)(IVM)指將未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(GV-COCs)從竇卵泡中取出,在特定的體外培養(yǎng)體系中培養(yǎng)成熟(MII-COCs)。IVM作為一項(xiàng)輔助生殖前沿技術(shù),尤其適用于卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)患者及多囊卵巢綜合征(PCOS)患者。此外,近年來(lái)也有學(xué)者提出,在一些激素敏感性腫瘤患者治療前可應(yīng)用IVM對(duì)其行生育力保存。但是大量的臨床數(shù)據(jù)表明,和體內(nèi)成熟卵子相比,IVM后的卵子發(fā)育潛能低,因此,IVM尚未廣泛應(yīng)用于臨床。探索IVM過(guò)程中卵丘細(xì)胞的狀態(tài)及相關(guān)基因表達(dá)有助于深入理解卵母細(xì)胞成熟機(jī)制并有望改進(jìn)IVM培養(yǎng)體系。小鼠COC體外培養(yǎng)和IVM,是此類(lèi)研究的最常用模型。近年來(lái),隨著高通量技術(shù)的發(fā)展,檢測(cè)GCs或CCs上基因表達(dá)譜成為可能。已見(jiàn)研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)及q-PCR技術(shù)嘗試分析CCs與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)的生物標(biāo)記物;也有研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)確定了不同培養(yǎng)條件下CCs上的基因表達(dá)譜差異。然而,鮮有關(guān)于IVM過(guò)程中CCs上基因表達(dá)譜變化的研究。因此,我們認(rèn)為,基于卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的相互交流理論,IVM過(guò)程中CCs上的基因表達(dá)譜發(fā)生一系列的變化,通過(guò)高通量技術(shù)可以獲得表達(dá)譜的變化,可望從中篩選出某些因子作為生物標(biāo)記物間接評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。為了驗(yàn)證以上科研假說(shuō),深入理解卵母細(xì)胞與CCs之間的相互交流及卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制,本研究以小鼠IVM及IVF為模型,應(yīng)用高通量技術(shù)研究CCs上基因表達(dá)譜特征,確定CCs上卵母細(xì)胞胞核及胞質(zhì)發(fā)育潛能相關(guān)生物標(biāo)記物,以期無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量。作為該研究的一部分,本文應(yīng)用小鼠IVM模型通過(guò)基因芯片技術(shù)建立IVM前后CCs上基因表達(dá)譜的變化,進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞內(nèi)亞定位及定量分析的技術(shù)探討從差異表達(dá)譜篩選的某些與卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)生物標(biāo)記物。材料與方法:⑴小鼠IVM模型建立:3周齡雌性ICR小鼠,予腹腔注射孕馬血清(PMSG)5U/只常規(guī)促排卵,獲取未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(GV-COCs),參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)建立小鼠IVM平臺(tái)。⑵CCs差異表達(dá)譜:分別從GV-COCs和MII-COCs中剝?nèi)Cs,對(duì)應(yīng)于GV-CCs組和MII-CCs組,每組包含3個(gè)混合CCs樣品(每個(gè)混合樣品含100枚COC)。分別提取總RNA,運(yùn)用基因芯片技術(shù)獲得差異表達(dá)譜。⑶生物信息學(xué)分析:確定差異表達(dá)基因、差異細(xì)胞功能和事件,并選擇某些候選研究基因。⑷基因芯片結(jié)果驗(yàn)證:根據(jù)芯片結(jié)果中的生物信息學(xué)分析結(jié)果,結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,挑選出感興趣的目的基因,運(yùn)用與芯片上樣時(shí)同樣的樣品行q-PCR水平驗(yàn)證。⑸差異基因的生物學(xué)意義:在芯片結(jié)果驗(yàn)證的基礎(chǔ)上,確定一些功能基因。擴(kuò)大樣本量,每組8個(gè)樣品(每個(gè)樣品含30枚COCs),重新收集樣品,行q-PCR驗(yàn)證。⑹目的基因的蛋白水平表達(dá)差異:分別從GV-COCs和MII-COCs中剝?nèi)Cs,通過(guò)Western Blot對(duì)以上確定的功能基因行蛋白水平的定量研究,免疫熒光方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位的研究。⑺統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料(MII率)統(tǒng)計(jì)采用卡方檢驗(yàn);計(jì)量資料(目的基因的蛋白表達(dá)和m RNA表達(dá)水平)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:⑴在本中心成功復(fù)制小鼠IVM模型,獲得GV-COCs和IVM后的MII-COCs,其平均成熟率(MII%)穩(wěn)定在92.6%。⑵通過(guò)基因芯片,獲得了IVM前后CCs上基因表達(dá)譜變化。按照FC≥3.0(Fold Change),同時(shí)P≤0.05篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。①M(fèi)II對(duì)GV上調(diào)基因有2615個(gè),主要涉及基質(zhì)金屬蛋白酶調(diào)節(jié)及表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等功能;②MII對(duì)GV下調(diào)基因有2810個(gè),主要涉及細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)生物學(xué)事件。⑶q PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果,發(fā)現(xiàn)IVM以后CCs上ECM和EFG相關(guān)基因(PTGS2,EREG,TNFAIP6,EFEMP1)以及線粒體代謝相關(guān)基因(FDX1,AIFM2)表達(dá)上調(diào)了;縫隙鏈接及細(xì)胞周期相關(guān)基因(GJA1,GJA4,CCND2,CCNA2,CCNB2)表達(dá)下調(diào)了。與芯片結(jié)果一致。⑷從以上目的基因中進(jìn)一步篩選出功能基因(EFEMP1,FDX1,GJA1,CCND2),重新收集樣品進(jìn)行生物學(xué)意義的驗(yàn)證,與芯片結(jié)果一致。⑸篩選出4個(gè)因子(EFEMP1,FDX1,GJA1,CCND2)進(jìn)行蛋白定量研究,發(fā)現(xiàn)與m RNA水平的變化一致。細(xì)胞內(nèi)定位研究發(fā)現(xiàn):①EFEMP1主要定位CCs的胞質(zhì)中,在GV-COC中僅表達(dá)在表層CCs上,內(nèi)層CCs不表達(dá),且在GV期卵子中不表達(dá);經(jīng)過(guò)IVM后,EFEMP1表達(dá)在全層CCs上,且MII其卵母細(xì)胞中高表達(dá);②FDX1也主要定位于CCs胞質(zhì)中,在GV-COC中內(nèi)外層CCs均有FDX1的表達(dá),且GV期卵母細(xì)胞中也有表達(dá);IVM后表達(dá)陽(yáng)性的CCs數(shù)目明顯增多;③GJA1只表達(dá)在CCs胞質(zhì)中,不表達(dá)與胞核中,在GV-COC中,GJA1在各層CCs中均有表達(dá);IVM后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少。且在GV期和MII期卵母細(xì)胞內(nèi),GJA1均不表達(dá);④CCND2主要表達(dá)在CCs的胞核中,胞質(zhì)中少量表達(dá),在GV-COC中,其主要表達(dá)在內(nèi)層CCs中;IVM以后這種表達(dá)極性消失,且熒光強(qiáng)度明顯減弱。結(jié)論:⑴研究生期間掌握了小鼠卵母細(xì)胞顯微鏡下操作技術(shù),在本中心成功復(fù)制IVM模型并應(yīng)用于課題研究中。⑵IVM過(guò)程中,隨著卵母細(xì)胞成熟,CCs上的基因表達(dá)譜發(fā)生一系列變化。IVM以后CCs上金屬蛋白酶調(diào)節(jié)及表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)了,細(xì)胞核相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)了�；蛐酒Y(jié)果利用q PCR技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。⑶通過(guò)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證,表明功能基因(EFEMP1,FDX1,GJA1,CCND2)在IVM過(guò)程中差異表達(dá),具有重要的生物學(xué)意義。⑷IVM過(guò)程中,隨之卵母細(xì)胞成熟的進(jìn)程CCs一些上調(diào)的因子(EFEMP1和FDX1)和下調(diào)因子(GJA1和CCND2)可望作為卵母細(xì)胞成熟及質(zhì)量相關(guān)的生物標(biāo)記物,也可能發(fā)展成為改進(jìn)IVM培養(yǎng)液的靶因子。
【關(guān)鍵詞】：卵丘細(xì)胞 卵母細(xì)胞體外成熟 基因表達(dá)譜 生物標(biāo)記 卵母細(xì)胞發(fā)育潛能
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-15
• 前言15-20
• 材料與方法20-32
• 結(jié)果32-43
• 討論43-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-65
• 文獻(xiàn)綜述65-86
• 參考文獻(xiàn)78-86
• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照86-88
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章情況88-89
• 致謝89

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9 郭曉英;不同培養(yǎng)因素對(duì)犬IVM卵母細(xì)胞形態(tài)和發(fā)育能力的影響[D];延邊大學(xué);2010年

10 邱志芳;牛早期卵母細(xì)胞和成熟前后的超微結(jié)構(gòu)變化[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

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