本文關(guān)鍵詞：甜瓜醇脫氫酶基因家族成員鑒定、分類及表達(dá)調(diào)控，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var. makuwa Makino)以其甘甜清脆和濃郁的香味深受消費(fèi)者喜愛,香氣是成熟薄皮甜瓜的重要品質(zhì)之一。在香氣物質(zhì)合成途徑中,醇脫氫酶是關(guān)鍵酶之一,而且,該酶是多基因家族,除了參與香氣物質(zhì)合成外,在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫等諸多方面均起作用。隨著甜瓜基因組測(cè)序完成,為研究甜瓜醇脫氫酶基因家族在甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育中的功能提供了便利。本研究利用甜瓜基因組網(wǎng)站進(jìn)行了醇脫氫酶基因家族成員的檢索,結(jié)果表明該家族主要包括乙醇脫氫酶(ADH)和肉桂醇脫氫酶(CAD)兩類基因亞家族,對(duì)這兩類基因家族進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析,克隆了3個(gè)關(guān)鍵基因；并以薄皮甜瓜“彩虹7”為試材,研究了ADH和CAD基因各成員在甜瓜不同組織器官和果實(shí)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期以及在采后果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中的表達(dá)模式,并探討了ABA、 IAA和乙烯處理對(duì)兩類基因各成員的表達(dá)調(diào)控,主要研究結(jié)果如下： 1.利用‘'alcohol dehydrogenase "和‘'cinnamyl alcohol dehydrogenase"為關(guān)鍵詞,在甜瓜基因組網(wǎng)站進(jìn)行檢索,獲得13個(gè)乙醇脫氫酶(ADHs)基因家族成員和5個(gè)肉桂醇脫氫酶(CADs)基因家族成員,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)13個(gè)ADHs基因家族中包括12個(gè)ADH成員和1個(gè)甲醛脫氫酶(FDH)基因,分別命名為CmADHl-12和CmFDHl;把CADs基因家族成員分別命名為CmCAD1-5.序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)甜瓜CmADH1、 CmADH3-11和CmCAD1-5氨基酸序列含有中鏈脫氫酶具有的特征序列：Zn1催化位點(diǎn)[GHE(X)2G(X)5G(X)2V], Zn2結(jié)合區(qū)域[GD(X)9,10C(X)2C(X)2C(X)7C],以及輔酶因子結(jié)合區(qū)[GXG(X)2G],推測(cè)這些基因?qū)儆谥墟湸济摎涿?CmADH2是短鏈脫氫酶；而CmADH12具有長(zhǎng)鏈特征序列NASD和AAAGGTG,可能屬于長(zhǎng)鏈ADH基因。 2.甜瓜ADHs和CADs基因家族系統(tǒng)發(fā)育和序列比對(duì)分析表明,植物ADH基因家族分為中鏈、短鏈和長(zhǎng)鏈醇脫氫酶類,甜瓜ADHs基因家族成員分別隸屬于這3類；植物CAD基因家族分為7類,甜瓜CADs基因家族成員分別隸屬于其中的4類。13個(gè)ADH氨基酸序列同源性為4.8%～52.48%,中鏈CmADH1和其他中鏈CmADH序列同源性為30%-40%；短鏈CmADH1與其他物種短鏈ADH基因同源性達(dá)80.38%;長(zhǎng)鏈CmADH12與其他物種ADH基因同源性達(dá)82.32%。甜瓜CmCAD1和CmCAD2歸類于bonafide CADs,兩者之間同源性為77.07%,而二者與其他CmCAD同源性低于50%；CmCAD3屬于第七類(groupVII), CmCAD4和CmCAD5分別屬于第五類(groupV)和第二類(groupll). CmCAD5和CmCAD3, CmCAD4之間同源性分別為58.52%和50.55%：CmCAD基因成員與其他物種中CAD基因序列同源性為77.05%-81.97%。根據(jù)CAD基因家族氨基酸序列中關(guān)鍵殘基的分析,CmCAD4可能是假基因或只特定在愈傷組織中表達(dá)。 3.根據(jù)從甜瓜基因組獲得的CmADH8, CmADH10和CmCAD2的核苷酸序列和ORF序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR法克隆了這2個(gè)ADH基因和CmCAD2基因。其中CmADH8全長(zhǎng)1671bp,ORF為1272bp,編碼423個(gè)氨基酸；CmADH10全長(zhǎng)1631bp,ORF為864bp,編碼287個(gè)氨基酸；CmCAD2全長(zhǎng)1160bp,ORF為1095bp,編碼364個(gè)氨基酸。3個(gè)基因核苷酸序列與基因組中相應(yīng)基因核苷酸序列同源性分別為94.92%、92.90%和97.75%。 4.甜瓜ADH基因家族成員在甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育過程中存在時(shí)空表達(dá)差異性。CmADH2. CmADH1o和CmFDH1在所有的營(yíng)養(yǎng)組織都表達(dá)并在雄花花瓣中表達(dá)強(qiáng)烈；CmADH9和CmADH11在所有組織中均不表達(dá)；CmADH4只在根中微弱表達(dá),CmADH5.CmADH6和CmADH7在所有組織中表達(dá)較弱；CmADH8在不同營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)有差異。ADH酶活性在不同組織中存在差異,雄花和雌花的酶活性最大,老葉中的最低。CmADH1. CmADH2.CmADH10和CmFDH1在不同生長(zhǎng)發(fā)育期的果實(shí)中都表達(dá),在果實(shí)生長(zhǎng)的中后期表達(dá)強(qiáng)烈,與果實(shí)中ADH酶活性變化一致。CmADH8和CmADH12在20DAA之后的果實(shí)中表達(dá)較高,且變化穩(wěn)定。這些結(jié)果暗示了ADH基因家族在甜瓜營(yíng)養(yǎng)器官及果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用,且存在成員之間的功能差異。 5.甜瓜CAD基因家族成員在甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育過程中也存在時(shí)空表達(dá)差異。除了老葉外,CmCAD5在各種組織中都表達(dá)強(qiáng)烈,且在雄花花瓣中表達(dá)最高；CmC4D4在所有組織中均不表達(dá)；CmCAD1-3在嫩莖中有較高的表達(dá)。CAD酶活性在不同組織中也存在差異,表現(xiàn)為嫩莖根雌花和雄花嫩葉老葉。CmCAD1在1DAA以及20-33DAA期間的果實(shí)中表達(dá)較高；CmCAD3在不同時(shí)期的果實(shí)中表達(dá)較低；CmCAD2和CmCAD5在不同生長(zhǎng)發(fā)育期的果實(shí)中都表達(dá),且在20DAA的果實(shí)中表達(dá)強(qiáng)烈,與果實(shí)中ADH酶和CAD酶活性變化一致。這些結(jié)果暗示了CAD基因家族成員參與了甜瓜營(yíng)養(yǎng)器官及果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育,且存在成員之間的功能差異。 6.隨著甜瓜果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育,果實(shí)感官品質(zhì)各指標(biāo)呈現(xiàn)差→良→差現(xiàn)象,與內(nèi)源乙烯變化趨勢(shì)一致；香氣成分中丁醇、反-3,順-6-壬二烯醇、苯甲醇、肉桂醇等物質(zhì)含量先升高后降低；己醛、肉桂醛、苯甲醛、反-2,順-6-壬二烯醛等物質(zhì)逐漸降低,醇類和醛類物質(zhì)種類和總含量隨果實(shí)發(fā)育逐漸減少；而乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸苯甲酯、肉桂醇乙酸酯等酯類物質(zhì)含量逐漸增加,隨著內(nèi)源乙烯高峰出現(xiàn)之后,酯類物質(zhì)種類和含量達(dá)到最大,之后稍有降低。ADH和CAD酶活性的變化趨勢(shì)與酯類物質(zhì)變化相似。結(jié)合部分CmADH和CmCAD基因家族成員在果實(shí)發(fā)育后期強(qiáng)烈表達(dá)的特性,表明這些成員可能參與了果實(shí)香氣物質(zhì)的生成,可能以基因家族網(wǎng)絡(luò)的形式發(fā)揮著作用。 7.采收30DAA的甜瓜果實(shí),在常溫下(23℃)貯藏12d。隨著果實(shí)后熟衰老,CmADH1.CmADH2.CmADH8.CmADH12和CmFDH1表達(dá)逐漸降低,而CmADH10o的表達(dá)較高且保持穩(wěn)定。CmADH3-6.CmADH9和CmADHll在果實(shí)后熟期間表達(dá)較弱或不表達(dá)。CmCADl的表達(dá)逐漸增強(qiáng),而CmCAD2、CmCAD3和CmCAD5的表達(dá)水平較低,并逐漸減弱,而CmCAD4在整個(gè)貯藏期間都不表達(dá)。 8.用100μL/L的外源乙烯處理30DAA果實(shí)24h；100μL/L1-MCP處理12h后,立即用100μL/L的外源乙烯處理24h,果實(shí)常溫下貯藏12天。乙烯處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)了4個(gè)CmCAD成員的表達(dá),并誘導(dǎo)了CmADH1-3, CmADH8, CmADH12和CmFDHl的表達(dá)。隨著貯藏時(shí)間的推移,CmCAD1、 CmCAD2和CmCAD5表達(dá)逐漸減弱,CmCAD3的轉(zhuǎn)錄水平從第1天之后迅速降低,其后一直保持恒定的表達(dá)水平,直到貯藏結(jié)束,而CmCAD4在任何處理的果實(shí)都不表達(dá)；1-MCP處理抑制了乙烯對(duì)ADH基因和CAD基因成員的誘導(dǎo)作用。采后貯藏期果實(shí)中ADH和CAD酶活性先升高后降低,與內(nèi)源乙烯變化一致；外源乙烯誘導(dǎo)了ADH酶和CAD酶活性的升高,但是酶活性變化趨勢(shì)與兩類基因成員的轉(zhuǎn)錄不完全一致。這兩種基因家族各成員對(duì)乙烯表現(xiàn)出不同的應(yīng)答模式。 9.利用外源100μM的ABA和IAA浸泡30DAA果實(shí)圓片,真空浸透2h后,發(fā)現(xiàn)ABA強(qiáng)烈誘導(dǎo)了CmADH1-4, CmADH1O和CmFAHl的表達(dá)。IAA處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)了CmADH6、 CmADH9和CmADH12的表達(dá),而其他的CmADHs基因?qū)AA不敏感,僅保持較低的轉(zhuǎn)錄水平。CmCAD1-3和CmCAD5基因表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)；IAA處理僅強(qiáng)烈誘導(dǎo)了CmCADl和CmCAD5的表達(dá),而CmCAD2-3基因?qū)AA不敏感。反應(yīng)了這兩類基因家族成員對(duì)ABA和IAA表現(xiàn)出不同的應(yīng)答模式。
【關(guān)鍵詞】：甜瓜 ADH基因家族 CAD基因家族 生物信息學(xué) 表達(dá)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：S652
【目錄】：

• 摘要10-13
• Abstract13-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-29
• 1.1 醇脫氫酶的基本特征16-18
• 1.1.1 醇脫氫酶的生化特性16-17
• 1.1.2 植物ADHs和CADs的分布17-18
• 1.2 植物醇脫氫酶超家族的進(jìn)化,分類及功能18-20
• 1.2.1 植物醇脫氫酶超家族的進(jìn)化18
• 1.2.2 ADHs家族成員的分類及功能18-19
• 1.2.3 CADs家族成員的分類及功能19-20
• 1.3 植物醇脫氫酶家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)成熟與衰老中的作用20-23
• 1.3.1 ADHs、CADs與乙烯的生物合成20-21
• 1.3.2 ADHs、CADs與植物生長(zhǎng)發(fā)育21-22
• 1.3.3 ADHs、CADs與果實(shí)生長(zhǎng)及成熟22
• 1.3.4 ADHs、CADs與果實(shí)香氣物質(zhì)22-23
• 1.4 植物醇脫氫酶家族在生物脅迫與非生物脅迫中的作用23-27
• 1.4.1 ADHs、CADs與非生物脅迫24-25
• 1.4.2 ADHs、CADs與生物脅迫25-27
• 1.5 本研究的目的和意義及主要研究?jī)?nèi)容27-29
• 第二章 基于基因組的甜瓜醇脫氫酶家族成員的鑒定及候選基因的克隆29-51
• 2.1 材料與方法29-32
• 2.1.1 試驗(yàn)材料29
• 2.1.2 試驗(yàn)方法29-32
• 2.2 結(jié)果與分析32-45
• 2.2.1 ADHs和CADs家族成員鑒定32-34
• 2.2.2 甜瓜ADH和CAD基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析34-35
• 2.2.3 ADHs基因家族的進(jìn)化分析及特征描述35-38
• 2.2.4 CADs基因家族的進(jìn)化分析及特征描述38-40
• 2.2.5 ADHs和CADs基因啟動(dòng)子序列分析40-44
• 2.2.6 ADHs和CADs基因家族候選成員的克隆44-45
• 2.3 討論45-49
• 2.3.1 ADHs基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析45-47
• 2.3.2 CADs基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析47-49
• 2.4 結(jié)論49-51
• 第三章 ADH和CAD基因家族在甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表達(dá)特性51-81
• 3.1 材料與方法51-55
• 3.1.1 試驗(yàn)材料51-52
• 3.1.2 試驗(yàn)方法52-55
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)方法55
• 3.2 結(jié)果與分析55-70
• 3.2.1 甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中果實(shí)硬度、果皮色度、內(nèi)源乙烯及SSC的變化55-58
• 3.2.2 甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中果實(shí)的感官評(píng)價(jià)58-60
• 3.2.3 ADHs和CADs基因家族成員器官特異性表達(dá)分析60-63
• 3.2.4 ADHs和CADs基因家族成員在甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)分析63-67
• 3.2.5 營(yíng)養(yǎng)組織中ADH酶和CAD酶的活性67-68
• 3.2.6 不同生長(zhǎng)發(fā)育期甜瓜果實(shí)中ADH和CAD的酶活性68
• 3.2.7 不同生長(zhǎng)發(fā)育期甜瓜果實(shí)中香氣物質(zhì)的生成68-70
• 3.3 討論70-80
• 3.3.1 ADHs基因在不同組織及甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間的表達(dá)70-78
• 3.3.2 CADs基因在不同組織及甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間的表達(dá)78-79
• 3.3.3 ADHs和CADs基因與甜瓜果實(shí)香氣物質(zhì)的生成79-80
• 3.4 結(jié)論80-81
• 第四章 采后甜瓜中ADH和CAD基因家族成員的表達(dá)調(diào)控81-96
• 4.1 材料與方法81-82
• 4.1.1 試驗(yàn)材料81-82
• 4.1.2 試驗(yàn)方法82
• 4.1.3 統(tǒng)計(jì)方法82
• 4.2 結(jié)果與分析82-92
• 4.2.1 果實(shí)硬度、果皮色度、內(nèi)源乙烯生成及SSC的變化82-84
• 4.2.2 ADH和CAD酶活性變化84
• 4.2.3 乙烯及1-MCP對(duì)ADHs和CADs基因家族成員表達(dá)特性的影響84-90
• 4.2.4 ADHs和CADs基因家族成員對(duì)IAA、ABA處理的應(yīng)答90-92
• 4.3 討論92-95
• 4.3.1 采后甜瓜中ADH基因家族成員的表達(dá)特性及乙烯的調(diào)控92-93
• 4.3.2 采后甜瓜中ADH基因家族成員對(duì)ABA及IAA的應(yīng)答模式分析93-94
• 4.3.3 采后甜瓜中CAD基因家族成員的表達(dá)特性及乙烯的調(diào)控94-95
• 4.3.4 采后甜瓜中CAD基因家族成員對(duì)ABA及IAA的應(yīng)答模式分析95
• 4.4 結(jié)論95-96
• 全文總結(jié)與展望96-98
• 本課題的特色與創(chuàng)新之處98-99
• 參考文獻(xiàn)99-112
• 附錄112-124
• 致謝124-125
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文125

【共引文獻(xiàn)】

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