本文關(guān)鍵詞：全氟化合物PFOA、PFOS內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：全氟化合物（PFCs）是一類具有重要應(yīng)用價(jià)值的有機(jī)化合物，因其具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、表面活性、疏水疏脂等特性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)和民用領(lǐng)域。PFCs廣泛分布在各種環(huán)境介質(zhì)和生物體內(nèi)，且具有難降解性和生物蓄積性，是一種新型持久性有機(jī)污染物（POPs）。近年來，PFCs對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來的不利影響受到全球的普遍關(guān)注，成為環(huán)境科學(xué)和毒理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 研究表明，PFCs能造成機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生紊亂，已成為環(huán)境內(nèi)分泌干擾效應(yīng)物（EDCs）篩檢的重點(diǎn)。全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）是兩種典型的PFCs，目前尚沒有對(duì)其內(nèi)分泌干擾活性的完整研究。國(guó)際上EDCs篩選程序中推薦采用體內(nèi)（in vivo）和體外（in vitro）試驗(yàn)的組合測(cè)試法。本項(xiàng)目采用代表性PFCs（PFOA、PFOS）作為研究對(duì)象，通過體外成組方法篩選受試物的擬/抗雌激素受體（ER）、雄激素受體（AR）、甲狀腺激素受體（TR）活性、過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）活性及對(duì)類固醇激素合成的影響，利用模式生物斑馬魚、SD大鼠，在體內(nèi)水平研究PFOA、PFOS對(duì)機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響及作用機(jī)制，綜合評(píng)價(jià)PFCs的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。 第一部分 體外試驗(yàn)篩選PFOA、PFOS的內(nèi)分泌干擾活性 第一節(jié)PFOA、PFOS對(duì)激素受體的干擾活性 目的 環(huán)境化合物可以通過受體介導(dǎo)途徑發(fā)揮內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，采用受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)體系，檢測(cè)和評(píng)價(jià)PFOA、PFOS對(duì)雌激素受體（ER）、雄激素受體（AR）、甲狀腺激素受體（TR）、過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）激動(dòng)或拮抗作用。 方法 通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將激素受體（ER、TR、PPAR）表達(dá)質(zhì)粒、含有相應(yīng)激素反應(yīng)元件的熒光素酶（Luc）報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到激素受體陰性的CV-1細(xì)胞中，建立ER、TR、PPAR介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)方法，用來檢測(cè)PFOA、PFOS的擬/抗雌激素、甲狀腺激素、過氧化物酶體增殖劑激活受體活性；利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雄激素反應(yīng)原件報(bào)告基因的MDA-Kb2細(xì)胞來檢測(cè)PFOA、PFOS的擬/抗雄激素活性。 結(jié)果 在ER介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)中，F(xiàn)POA、PFOS單獨(dú)作用，不能顯著誘導(dǎo)報(bào)告基因Luc的表達(dá)；與1×10-9M E2共同作用，在受試濃度3×10-9-3×10-7M內(nèi)可協(xié)同E2增強(qiáng)報(bào)告基因Luc的表達(dá)。在AR介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)PFOA、PFOS對(duì)Luc有明顯的誘導(dǎo)和抑制作用。在TR介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)中，PFOA（1×10-8-3×10-7M）、PFOS（1×10-7M、3×10-7M）能抑制5×10-9M T3誘導(dǎo)的Luc表達(dá)量。在PPAR介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)中，PFOA、PFOS在受試范圍內(nèi)表現(xiàn)出PPAR激動(dòng)作用。 結(jié)論 PFOA、PFOS具有雌激素協(xié)同活性、抗甲狀腺激素活性、PPAR激動(dòng)活性。 第二節(jié)PFOA、PFOS對(duì)類固醇激素合成的影響 目的 環(huán)境化合物可以通過非受體介導(dǎo)途徑來發(fā)揮內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，通過研究PFOA、PFOS對(duì)類固醇激素合成過程的影響，來評(píng)價(jià)它們的類固醇激素合成干擾效應(yīng)。 方法 采用人腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞H295R，檢測(cè)PFOA、PFOS作用后對(duì)H295R細(xì)胞中類固醇激素（雌二醇和睪酮，即E2和T）水平、類固醇激素合成過程中關(guān)鍵酶基因及關(guān)鍵調(diào)控因子（SF-1）表達(dá)的影響。 結(jié)果 PFOA在1×10-8M及更高濃度時(shí)，增加細(xì)胞內(nèi)E2的水平，在3×10-8M及以上，抑制T的水平。PFOS在3×10-8M及以上，增加E2的表達(dá)，在1×10-7M和3×10-7M濃度時(shí)，降低T的表達(dá)。PFOA、PFOS可以不同程度的改變類固醇合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。在10種與類固醇激素合成相關(guān)的基因中，PFOA作用后顯著上調(diào)17βHSD1、3βHSD2、CYP11B2、CYP19的表達(dá)，下調(diào)CYP17、17βHSD4、CYP11A的表達(dá)。PFOS暴露后顯著上調(diào)HMGR、StAR、CYP11A、CYP19、3βHSD2、CYP11B2的表達(dá)，下調(diào)CYP17、17βHSD1、CYP21的表達(dá)。PFOA暴露還可導(dǎo)致類固醇合成關(guān)鍵調(diào)控因子SF-1的基因和蛋白表達(dá)水平降低。 結(jié)論 PFOA、PFOS可以影響H295R細(xì)胞中類固醇激素的合成過程，具有類固醇激素合成干擾效應(yīng)。 第二部分 體內(nèi)試驗(yàn)研究PFOA、PFOS的內(nèi)分泌干擾效應(yīng) 第一節(jié)PFOA、PFOS對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響 目的 利用模式生物斑馬魚，研究PFOA、PFOS短期暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育、內(nèi)分泌相關(guān)基因以及整體基因表達(dá)的影響。 方法 受精后4h（4hpf）的斑馬魚胚胎，用100、200、500μg/L的PFOA、PFOS染毒至120hpf。觀察斑馬魚胚胎/幼魚的生長(zhǎng)狀況，包括胚胎死亡、孵化、生長(zhǎng)發(fā)育、有無胚胎發(fā)育畸形等情況。檢測(cè)120hpf的斑馬魚幼魚體內(nèi)內(nèi)分泌相關(guān)基因（包括雌激素受體表達(dá)基因esr1、esr2b，甲狀腺早期分化關(guān)鍵基因hhex、pax8，類固醇激素合成基因cyp19a、cyp19b、cyp17）的表達(dá)情況。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行單一濃度多暴露終點(diǎn)的斑馬魚胚胎暴露試驗(yàn)。選擇500μg/L的PFOA、PFOS在斑馬魚4hpf-120hpf期間染毒，染毒至12hpf、24hpf、48hpf、72hpf、96hpf、120hpf，觀察各時(shí)間點(diǎn)的胚胎發(fā)育情況，選取暴露至120hpf的斑馬魚幼魚，利用斑馬魚表達(dá)譜芯片檢測(cè)整體基因的表達(dá)情況，分析篩選出關(guān)鍵差異表達(dá)基因。 結(jié)果 在4hpf-120hpf染毒期間，受試濃度下的PFOA、PFOS對(duì)斑馬魚胚胎/幼魚的生長(zhǎng)發(fā)育沒有產(chǎn)生明顯影響，但可引起斑馬魚幼魚內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。與對(duì)照組相比，500μg/L的PFOA引起esr1基因水平的上調(diào)，對(duì)esr2b的表達(dá)無影響；200μg/L、500μg/L的PFOA能顯著增加hhex、pax8的表達(dá)量；PFOA對(duì)類固醇合成酶相關(guān)基因的影響不大。在最高濃度下，PFOS暴露使esr1的表達(dá)量增加、esr2b的表達(dá)量降低；PFOS濃度依賴性的增加hhex和pax8的表達(dá)；200μg/L、500μg/L的PFOS暴露能顯著抑制cyp19a、cyp19b、cyp17的表達(dá)。120hpf的斑馬魚表達(dá)譜芯片結(jié)果提示，多個(gè)通路上的多種基因在PFOS暴露后發(fā)生改變，差異表達(dá)基因主要參與到細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)控、發(fā)育等生物學(xué)過程。 結(jié)論 PFOA、PFOS暴露可對(duì)斑馬魚的基因表達(dá)產(chǎn)生影響，發(fā)揮潛在的干擾效應(yīng)。 第二節(jié)PFOA、PFOS對(duì)大鼠青春期發(fā)育的影響 目的 環(huán)境化合物暴露與青春期啟動(dòng)時(shí)間的異常密切相關(guān)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PFOA、PFOS的暴露和青春期啟動(dòng)的改變有關(guān)，但對(duì)其干擾青春期發(fā)育的相關(guān)機(jī)制一直未得到闡明。我們采用雌性大鼠模型，研究PFOA、PFOS在關(guān)鍵時(shí)間段暴露對(duì)雌性青春期啟動(dòng)和發(fā)育的影響，并探究其相關(guān)機(jī)制。 方法 采用SD雌性大鼠，在新生期（出生后1-5天，PND1-5）和青春前期（出生后26-30天，PND26-30）兩個(gè)暴露階段分別進(jìn)行不同劑量的PFOA、PFOS（0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg）染毒。測(cè)定大鼠出生時(shí)、PND15、PND25、PND35、陰道開口日的體重和肛門-生殖器距離（AGD），記錄雌鼠進(jìn)入青春期的年齡（陰道開口時(shí)間）、首次發(fā)情期時(shí)間、雌性周期，檢測(cè)血清雌激素和促黃體生成素（LH）的水平，計(jì)算卵巢系數(shù)，進(jìn)行卵巢組織病理分析和卵泡計(jì)數(shù)。采用Q-RT-PCR分析下丘腦Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)中Kiss1、Kiss1r、ERα、ERβ基因表達(dá)的變化，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)kisspeptin蛋白表達(dá)水平，，以探討該系統(tǒng)在PFOA、PFOS所致的青春期啟動(dòng)時(shí)間改變中發(fā)揮的作用。選擇染毒雌鼠的肝臟組織，測(cè)定肝臟系數(shù)，進(jìn)行肝臟功能相關(guān)血生化指標(biāo)的檢測(cè)，采用GC-MS進(jìn)行血清脂肪酸組、肝臟代謝組測(cè)定，以探討PFOA、PFOS在發(fā)育關(guān)鍵期短期暴露對(duì)肝臟功能的影響。 結(jié)果 新生期、青春前期10mg/kg PFOA、1mg/kg和10mg/kg PFOS短期暴露，可引起雌鼠陰道開口時(shí)間比對(duì)照組早4-5天，提前進(jìn)入青春期。新生期PFOA、PFOS暴露后，以非劑量依賴性的方式增加雌鼠體重和AGD；青春前期暴露也可增加雌鼠PND35的體重。在兩個(gè)暴露階段處理后，低、中劑量的PFOA、PFOS染毒組大鼠都能出現(xiàn)不規(guī)律的雌性周期，表現(xiàn)為延長(zhǎng)的靜止期或發(fā)情后期。PND1-5和PND26-30暴露于PFOA、PFOS的雌鼠血清雌激素和LH水平上升，新生期對(duì)激素的影響強(qiáng)于青春前期�；衔锶径疚匆鹇殉步M織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，但可影響卵泡數(shù)量，在新生期低劑量的PFOA、PFOS組大鼠可見生長(zhǎng)卵泡數(shù)量減少。下丘腦前腹側(cè)室周核（AVPV）和弓狀核（ARC）區(qū)域Kiss1、Kiss1r、ERα的基因水平下降，免疫組化結(jié)果顯示kisspeptin纖維密度在PFOA、PFOS的高劑量暴露組受到抑制，與基因表達(dá)的結(jié)果趨勢(shì)大體相同。對(duì)于大鼠肝臟，高劑量組的PFOA、PFOS可以增加肝臟重量。GC-MS分析結(jié)果顯示，血清中多種脂肪酸的含量發(fā)生改變，肝臟代謝小分子分析顯示，PFOA、PFOS導(dǎo)致的差異表達(dá)物質(zhì)主要集中在代謝通路、半乳糖代謝通路、脂肪酸合成通路等。 結(jié)論 新生期、青春前期短期暴露于環(huán)境劑量下的PFOA、PFOS能夠影響下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的調(diào)控，導(dǎo)致雌性青春期啟動(dòng)的提前，其中kisspeptin/GPR54系統(tǒng)在其中起了關(guān)鍵作用。新生期暴露于PFOA、PFOS也可影響體內(nèi)脂肪酸代
【關(guān)鍵詞】：報(bào)告基因 ER AR TR PPAR H295R類固醇合成試驗(yàn) 類固醇激素 激素合成關(guān)鍵基因 SF-1 斑馬魚胚胎短期暴露試驗(yàn) 斑馬魚表達(dá)譜芯片 青春期 陰道開口 Kisspeptin/GPR54 肝臟 代謝
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-19
• 序言19-24
• 第一部分 體外試驗(yàn)篩選 PFOA、PFOS 的內(nèi)分泌干擾活性24-56
• 第一節(jié) PFOA、PFOS 對(duì)激素受體的干擾活性24-38
• 前言24-25
• 材料與方法25-30
• 結(jié)果30-35
• 討論35-38
• 第二節(jié) PFOA、PFOS 對(duì)類固醇激素合成的影響38-56
• 前言38-39
• 材料與方法39-49
• 結(jié)果49-53
• 討論53-56
• 第二部分 體內(nèi)試驗(yàn)研究 PFOA、PFOS 的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)56-120
• 第一節(jié) PFOA、PFOS 對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響56-77
• 前言56-57
• 材料與方法57-62
• 結(jié)果62-74
• 討論74-77
• 第二節(jié) PFOA、PFOS 對(duì)大鼠青春期發(fā)育的影響77-120
• 前言77-79
• 材料與方法79-89
• 結(jié)果89-113
• 討論113-120
• 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)120-121
• 參考文獻(xiàn)121-135
• 綜述135-177
• 參考文獻(xiàn)168-177
• 附錄177-183
• 致謝183-184

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1 金一和,舒為群,丁梅,翟成,齊藤憲光,佐佐木和明,安部隆司;兩地區(qū)一般人群血清中PFOS和PFOA污染特征比較[J];毒理學(xué)雜志;2005年S1期

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本文編號(hào)：294454