本文關(guān)鍵詞：葡萄SnRK2基因家族的全基因組鑒定、表達(dá)分析及VvSnRK2.2基因的功能驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：葡萄(Vitis vinifera L.)是葡萄科葡萄屬落葉藤本植物,是世界上廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)果樹之一。隨著社會(huì)的發(fā)展和人口的增多,環(huán)境日益惡化。干旱、鹽漬化、高溫、低溫以及氧化脅迫等都嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育,進(jìn)而影響果樹的產(chǎn)量和品質(zhì),因而提高植物的抗逆性成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)研究的主要目標(biāo)之一。SnRK2(蔗糖非發(fā)酵1型相關(guān)蛋白激酶2；Sucrose non-fermenting1-related protein kinases2),是植物體所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶。研究表明,SnRK2家族成員在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用,包括細(xì)胞分化、植物代謝、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)錄以及對(duì)干旱、極端溫度和鹽漬化等非生物脅迫的響應(yīng)等。本論文的主要研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)方面：1、運(yùn)用生物信息學(xué)的方法,從全基因組水平上鑒定葡萄SnRK2家族成員基因,并對(duì)其系統(tǒng)發(fā)生、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、motif、C末端序列和EST等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；2、利用基因芯片數(shù)據(jù)和熒光定量RT-PCR對(duì)葡萄SnRK2家族基因在組織/器官發(fā)育及不同生物/非生物脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析；3、在5BB中克隆了VvSnRK2.2基因,成功構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)載體,并利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化擬南芥,以進(jìn)一步了解其功能。主要結(jié)果如下： 1.利用隱馬可夫模型(HMM)搜索和系統(tǒng)建樹的方法,在葡萄中共鑒定出了6個(gè)VvSnRK2基因,并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、motif、C末端和EST等的預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明,葡萄VvSnRK2家族為親水性蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以a-螺旋和不規(guī)則卷曲為主；在系譜發(fā)生上葡萄VvSnRK2s蛋白分為3個(gè)亞族；基因結(jié)構(gòu)分析表明,葡萄中6個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子的分布非常保守,所有基因都含有9個(gè)外顯子,并且除了VvSnRK2.3基因的內(nèi)含子插入位點(diǎn)為1相位之外,所有基因內(nèi)含子的插入位點(diǎn)都為O相位；motif和C末端序列分析表明,葡萄SnRK2基因家族具有較高的保守性；EST分析表明,6個(gè)基因在10個(gè)組織中呈不均勻分布,其中主要分布在果實(shí)、細(xì)胞懸浮物、葉片和花中。 2.利用芯片數(shù)據(jù)分析了葡萄中6個(gè)SnRK2基因在組織/器官發(fā)育及生物/非生物脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。組織發(fā)育芯片數(shù)據(jù)表明,VvSnRK2s參與種子發(fā)育及果實(shí)的發(fā)育和衰老,并受到生物和非生物脅迫的誘導(dǎo)。在種子發(fā)育中,VvSnRK2.1.VvSnRK2.2和VvSnRK2.3主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá),VvSnRK2.5為下調(diào)表達(dá)。在果實(shí)發(fā)育和衰老過(guò)程中,多數(shù)VvSnRK2基因都表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá),且以VvSnRK2.5下調(diào)表達(dá)最為顯著；在生物/非生物脅迫芯片數(shù)據(jù)分析中,VvSnRK2.6受白粉病和高溫的誘導(dǎo),而VvSnRK2.1受水分脅迫和鹽的誘導(dǎo)；ABA的芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,即第一亞家族不受ABA的誘導(dǎo),第二亞家族受ABA的微弱誘導(dǎo),第三亞家族受ABA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。 3.為了進(jìn)一步了解葡萄中6個(gè)SnRK2(VvSnRK2.1-VvSnRK2.6)基因的表達(dá)模式及功能,我們利用熒光定量RT-PCR的方法分析了這6個(gè)基因在ABA、干旱、NaCl、高溫(45℃)和低溫(4℃)等處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明,VvSnRK2.1在干旱和NaCl處理后顯著上調(diào)表達(dá),與芯片數(shù)據(jù)相一致；VvSnRK2.2和VvSnRK2.4受到高溫的誘導(dǎo)；VvSnRK2.3受低溫的誘導(dǎo)；VvSnRK2.1和VvSnRK2.5受ABA的顯著誘導(dǎo)。 4.為了進(jìn)一步驗(yàn)證葡萄VvSnRK2家族基因的功能,我們從葡萄砧木5BB中克隆了VvSnRK2.2基因,構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體(35S:VvSnRK2.2),轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,并利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化擬南芥,初步GUS染色獲得了6個(gè)抗性株系,利用RT-PCR對(duì)2株抗性株系L34和L42進(jìn)行了檢測(cè)。以轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代種子和幼苗為材料,對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行了非生物脅迫抗性分析,結(jié)果表明,在ABA (10μM和50μM)處理培養(yǎng)基上,L34和L42轉(zhuǎn)基因株系比野生型(WT)的反應(yīng)更加敏感,且在對(duì)照(CK)和各種處理培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片生長(zhǎng)正常,而野生型(WT)葉片在ABA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6天后表現(xiàn)為上翹(或向上卷曲),初步推測(cè),該基因可能與氣孔的運(yùn)動(dòng)或葉片組織結(jié)構(gòu)有關(guān)系；通過(guò)植物抗旱性分析,證明VvSnRK2.2能夠提高擬南芥對(duì)干旱的抗性,而在NaCl處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照更加敏感。
【關(guān)鍵詞】：葡萄 VvSnRK2 生物信息學(xué)分析 RT-PCR 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：S663.1
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 縮略語(yǔ)12-13
• 引言13-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-34
• 1 蛋白激酶14-19
• 1.1 蛋白激酶的分類14
• 1.2 植物蛋白激酶研究進(jìn)展14-19
• 1.2.1 受體蛋白激酶(RLK)15-16
• 1.2.2 分裂原激活蛋白激酶(MAPK)16-17
• 1.2.3 鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴蛋白激酶(CDPK)17
• 1.2.4 蔗糖非發(fā)酵1型相關(guān)蛋白激酶(SnRK)17-19
• 2 S RK2蛋白激酶家族結(jié)構(gòu)19-20
• 3 S RK2蛋白激酶的活性及表達(dá)20-21
• 4 SnRK2蛋白激酶家族的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)21-23
• 5 本研究的目的和意義23-25
• 參考文獻(xiàn)25-34
• 第二章 葡萄SnRK2基因家族的全基因組鑒定和生物信息學(xué)分析34-48
• 摘要34-35
• 1 材料和方法35-37
• 1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索35-36
• 1.2 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建36
• 1.3 S RK2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析36
• 1.4 SnRK2基因結(jié)構(gòu)分析36
• 1.5 SnRK2 C-末端motif分析36
• 1.6 SnRK2 C-末端序列比對(duì)分析36-37
• 1.7 SnRK2的EST分析37
• 2 結(jié)果與分析37-44
• 2.1 葡萄SnRK2候選基因的確定和染色體的定位37-38
• 2.2 葡萄SnRK2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析38
• 2.3 葡萄SnRK2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析38
• 2.4 葡萄SnRK2的系譜發(fā)生38-41
• 2.5 葡萄SnRK2的基因結(jié)構(gòu)分析41-42
• 2.6 葡萄SnRK2的C末端motif分析42-43
• 2.7 葡萄SnRK2 C-末端序列比對(duì)分析43
• 2.8 葡萄SnRK2的EST表達(dá)分析43-44
• 3 討論44-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 第三章 葡萄SnRK2家族基因的表達(dá)分析48-72
• 摘要48-49
• 1 材料和方法49-53
• 1.1 芯片數(shù)據(jù)49
• 1.2 材料和處理49-50
• 1.3 引物50-51
• 1.4 試劑和儀器51
• 1.5 方法51-53
• 1.5.1 總RNA的提取51
• 1.5.2 總RNA中DNA的消化及cDNA第一鏈的合成51-52
• 1.5.3 熒光定量PCR分析52-53
• 2 結(jié)果與分析53-61
• 2.1 葡萄SnRK2基于芯片數(shù)據(jù)的表達(dá)分析53-56
• 2.1.1 葡萄SnRK2基因在不同組織、器官及其不同發(fā)育階段的表達(dá)情況53-55
• 2.1.2 葡萄SnRK2響應(yīng)生物和非生物脅迫的表達(dá)情況55-56
• 2.1.3 葡萄SnRK2響應(yīng)外源ABA的表達(dá)情況56
• 2.2 葡萄SnRK2基于熒光定量PCR(qRT-PCR)的表達(dá)分析56-61
• 2.2.1 處理材料RNA的提取56-57
• 2.2.2 葡萄SnRK2基因熒光引物篩選57-58
• 2.2.3 干旱處理?xiàng)l件下葡萄中6個(gè)SnRK2基因的表達(dá)情況58
• 2.2.4 NaCl處理?xiàng)l件下葡萄中6個(gè)SnRK2基因的表達(dá)情況58
• 2.2.5 高溫處理?xiàng)l件下葡萄6個(gè)SnRK2基因的表達(dá)情況58-59
• 2.2.6 低溫處理?xiàng)l件下葡萄中6個(gè)VvSnRK2基因的表達(dá)情況59
• 2.2.7 ABA處理?xiàng)l件下葡萄中6個(gè)SnRK2基因的表達(dá)情況59-61
• 3 討論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-72
• 第四章 葡萄VvSnRK2.2的克隆、序列分析及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化72-88
• 摘要72-73
• 1 材料和方法73-79
• 1.1 材料73-74
• 1.1.1 植物材料73
• 1.1.2 儀器、試劑和耗材73
• 1.1.3 載體質(zhì)粒和農(nóng)桿菌菌株73-74
• 1.2 方法74-79
• 1.2.1 基因克隆74-77
• 1.2.2 載體構(gòu)建77-78
• 1.2.3 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化(花粉管通道法)78-79
• 2 結(jié)果與分析79-86
• 2.1 基因的克隆與序列分析79-83
• 2.1.1 總RNA的提取79-80
• 2.1.2 VvSnRK2.2基因的克隆80
• 2.1.3 VvSnRK2.2基因的序列分析80-83
• 2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建83-84
• 2.2.1 帶酶切位點(diǎn)的VvSnRK2.2基因的克隆83
• 2.2.2 載體構(gòu)建成功農(nóng)桿菌菌液檢測(cè)83-84
• 2.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的檢測(cè)84-86
• 2.3.1 TO代轉(zhuǎn)基因種子的初步篩選84
• 2.3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色結(jié)果84-85
• 2.3.3 轉(zhuǎn)基因株系T3代GUS染色85
• 2.3.4 RT-PCR檢測(cè)85-86
• 3 討論86-87
• 參考文獻(xiàn)87-88
• 第五章 VvSnRK2.2基因的功能驗(yàn)證88-98
• 摘要88-89
• 1 材料和方法89-90
• 1.1 材料89
• 1.1.1 植物材料89
• 1.1.2 儀器和試劑89
• 1.2 方法89-90
• 1.2.1 轉(zhuǎn)基因株系在正常生長(zhǎng)條件下的表型觀察89
• 1.2.2 轉(zhuǎn)基因株系在各種脅迫處理?xiàng)l件下的表型觀察89-90
• 2 結(jié)果與分析90-96
• 2.1 野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽狀態(tài)90
• 2.2 野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系的初生根長(zhǎng)度90-91
• 2.3 野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系非生物脅迫抗性分析91-96
• 2.3.1 野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥在對(duì)照培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況91
• 2.3.2 NaCl(100mM)處理?xiàng)l件下的表型觀察91-92
• 2.3.3 ABA(1OμM和50μM)處理?xiàng)l件下的表型觀察92-94
• 2.3.4 轉(zhuǎn)基因株系抗旱性分析94-96
• 3 討論96-97
• 參考文獻(xiàn)97-98
• 全文結(jié)論98-100
• 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)100-102
• 附錄102-106
• 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表論文106-108
• 致謝108

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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3 周慶紅,李成瓊,匡全;植物蛋白激酶研究進(jìn)展[J];生物學(xué)雜志;2003年03期

4 郁松林,黃衛(wèi)東;高溫脅迫下葡萄葉片蛋白激酶的誘導(dǎo)形成與活性變化[J];植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào);2004年03期

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  本文關(guān)鍵詞：葡萄SnRK2基因家族的全基因組鑒定、表達(dá)分析及VvSnRK2.2基因的功能驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：289183