隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,有疾病防治和促進生長功能的抗生素類藥物和重金屬常作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用在畜禽醫(yī)療和養(yǎng)殖業(yè)中,其中以四環(huán)素類抗生素和重金屬銅的使用量最多�？股氐膹V泛使用和低效移除導(dǎo)致目前大量的抗生素持續(xù)輸出到水環(huán)境中。近年來,抗生素藥物在污水廠、地表水、地下水甚至飲用中都有檢出。高濃度抗生素一方面會對水生生物產(chǎn)生毒害作用,威脅水生生態(tài)系統(tǒng)的安全,另一方面,抗生素的長期暴露會誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生耐藥性,并對人類健康安全造成威脅。目前水體環(huán)境中殘存藥物的環(huán)境風(fēng)險是國際研究的熱點。雖然抗生素的環(huán)境監(jiān)測已有不少文獻報道,但對于四環(huán)素類抗生素的環(huán)境效應(yīng)及機制研究并不多。環(huán)境中重金屬銅的濃度升高時,一方面會直接對水生生物產(chǎn)生毒性效應(yīng),另一方面,當抗生素同時存在時,還會增加環(huán)境中抗性基因的豐度和傳播。目前對于四環(huán)素與銅的復(fù)合污染的環(huán)境效應(yīng)所知不多�；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀,本論文選取斑馬魚為模式生物,以四環(huán)素和重金屬銅為研究對象,針對四環(huán)素、銅對斑馬魚胚胎的單一毒性效應(yīng)及機制進行了研究,并對兩者的復(fù)合污染做了初步探索。第一部分內(nèi)容是應(yīng)用急性暴露實驗、AO染色、RT-PCR等生物學(xué)方法,研究了四環(huán)素的水生毒理效應(yīng)。毒性效應(yīng)方面,四環(huán)素的96h急性暴露實驗結(jié)果表明四環(huán)素(2-20,000μg/L)對斑馬魚胚胎的存活率無明顯影響,但四環(huán)素明顯抑制了斑馬魚胚胎的生長發(fā)育(p0.05),主要表現(xiàn)為孵化延遲、體長變短、卵黃囊腫脹和魚鰾缺失等效應(yīng)。經(jīng)過分析得出四環(huán)素對斑馬魚胚胎96h的EC1o為3.16μg/L,低于實際環(huán)境濃度。在毒理機制研究方面,四環(huán)素暴露(10-200μg/L)導(dǎo)致幼魚的SOD和CAT基因的表達量明顯上調(diào),并且斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS含量明顯上升(p0.05),說明四環(huán)素對斑馬魚的早期發(fā)育產(chǎn)生了氧化損傷。AO染色結(jié)果表明四環(huán)素(5,10,201μg/L)導(dǎo)致斑馬魚幼魚的尾部和心臟區(qū)域產(chǎn)生了細胞凋亡。細胞凋亡相關(guān)基因表達結(jié)果顯示四環(huán)素對斑馬魚胚胎產(chǎn)生的細胞凋亡可能是由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的,因此推測Caspase細胞凋亡信號通路可能是四環(huán)素誘導(dǎo)斑馬魚早期發(fā)育產(chǎn)生細胞凋亡的主要信號通路。另外,ABCC基因和藥物代謝基因(細胞色素p450)的表達結(jié)果顯示四環(huán)素可以誘導(dǎo)斑馬魚胚胎產(chǎn)生耐藥性。針對銅的水生毒理效應(yīng)研究,本文運用了急性暴露實驗(96h)來研究其對斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng),結(jié)果顯示,銅具有明顯的致死和致畸效應(yīng),其對斑馬魚胚胎96h的LC1o為2.5 μg/L,EC1o為0.1μg/L。在表型效應(yīng)方面,銅(2.56-256 gg/L)抑制了斑馬魚胚胎的生長發(fā)育,表現(xiàn)為延遲了斑馬魚胚胎的孵化、卵黃囊吸收、頭部、魚鰾和體長等生長指標的發(fā)育。在毒理機制的研究中,運用了ICP-MS、RT-PCR和AO染色三種方法,數(shù)據(jù)表明,斑馬魚對不同濃度銅的相對吸收率隨著濃度的上升而下降,頭部對銅的富集程度要比軀干部位更明顯；RT-PCR數(shù)據(jù)表明,環(huán)境濃度的銅可能通過影響神經(jīng)和心臟相關(guān)基因的表達引起斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育和心臟發(fā)育異常,但并未對MT基因產(chǎn)生顯著性變化。AO染色結(jié)果顯示銅導(dǎo)致斑馬魚幼魚心臟區(qū)域產(chǎn)生了細胞凋亡,同時還有少量的凋亡細胞集中在幼魚的尾部。最后一部分是對四環(huán)素和銅的復(fù)合污染的研究工作。首先,兩者96h持續(xù)聯(lián)合暴露的結(jié)果表明,與銅的單一毒性相比,在加入不同濃度的四環(huán)素(10-1000μg/L)后,存活率、孵化率、頭部發(fā)育和卵黃囊營養(yǎng)吸收等指標在不同程度上都有所緩解(p0.05)。ICP-MS的數(shù)據(jù)表明,四環(huán)素能明顯降低斑馬魚幼魚體內(nèi)的總銅含量(p0.05)。因此,我們推測兩者相互作用形成絡(luò)合物減少了斑馬魚胚胎吸收的銅含量,從而緩解了銅的毒性效應(yīng),這些結(jié)論表明了四環(huán)素和銅之間的復(fù)合污染類型屬于拮抗作用。綜合以上論述,本論文的研究結(jié)果表明,四環(huán)素對斑馬魚胚胎具有發(fā)育毒性,可以明顯抑制胚胎的生長發(fā)育。四環(huán)素對斑馬魚胚胎的毒性機制可能是通過形成ROS,對機體產(chǎn)生氧化損傷,氧化損傷進一步導(dǎo)致幼魚產(chǎn)生細胞凋亡,進而抑制斑馬魚胚胎的生長發(fā)育。環(huán)境濃度的銅可能通過細胞凋亡、分子層面的變化等方式對斑馬魚的早期生長發(fā)育產(chǎn)生危害,如延遲生長發(fā)育和影響神經(jīng)和心臟發(fā)育,另外銅可通過和四環(huán)素等環(huán)境中其他污染物的結(jié)合降低銅離子的生物有效性和毒性。所有的這些數(shù)據(jù)和結(jié)論可以為抗生素和重金屬的生態(tài)風(fēng)險評價以及環(huán)境標準的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X171.5
【部分圖文】：

環(huán)境中（Ｈｉｒｓｃｈｅｔａｌ．，?１９９９）。而低濃度的抗生素及其代謝產(chǎn)物在水體中不僅會誘導(dǎo)產(chǎn)生??抗性基因（Ｂａｑｕｅｒｏ?ｅｔ?ａｌ．，?２００８），還會對水生生物及人類產(chǎn)生潛在的毒性效應(yīng)（Ｃｒａｎｅ?ｅｔ??ａｌ．，２００６）。水環(huán)境中抗生素的來源、遷移途徑和作用對象歸納見圖１?（章強等，２０１４）。??ｃｒＵ???抗生素生產(chǎn)??士?＼??工業(yè)廢水人類醫(yī)用養(yǎng)殖業(yè)??Ｉ?＼?？??？?類便??污水處理廠?Ｉ?１１１??Ｉ?土壤?人類??地表水飲用水?’??丄八丨關(guān)??水生生物?地下水沉積物??－?”?一?Ｉ?ｉ??圖１水環(huán)境中抗生素的來源與歸趨??Ｆｉｇ．?１?Ｓｏｕｒｃｅｓ?ａｎｄ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ｒｏｕｔｅｓ?ｏｆ?ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ?ｉｎ?ｗａｔｅｒ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ??２??

我國是抗生素使用大國，特別是在人口密度高、發(fā)展速度快的長江三角洲地區(qū)。長??江口水域的抗生素檢測開展的時間較遲，近年來，一些研宄者相繼檢測了上海市地表水??中抗生素的含量，表１總結(jié)了近年來上海市地區(qū)地表水中各類抗生素的含量，圖２為上??海水域的部分采樣點以及主要抗生素的組成情況（章強等，２０１４），可以看出長江口主??要的抗生素是氯霉素類和磺胺類抗生素（Ｙａｎｅｔａｌ．，２０１３），氯霉素類中檢測濃度最高的??是甲砜霉素（表１），能達到ｌｌＯｎｇ／Ｌ擴胺類中為磺胺卩比唆濃度最高，濃度為２１９ｎｇ幾。??Ｊｉａｎｇ等（２０１１）和沈群輝等（２０１２）的研究結(jié)果表明黃浦江污染較嚴重的是磺胺類和??四環(huán)素類抗生素。另外Ｊｉａｎｇ等（２０１１）于２０１１年針對黃浦江中抗生素的濃度進行了季??節(jié)性的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大部分抗生素的濃度冬季明顯比夏季高，其中橫胺類抗生素冬季的濃??度要比夏季高１－１０２倍，四環(huán)素類抗生素在夏季的總濃度（５．６１－６３．２６?ｎｇ／Ｌ）是冬季??（１９．１５－１４７．１５?ｎｇ／Ｌ）的一半，另外抗生素的檢出種類和頻率都呈現(xiàn)這種冬季高于夏季??的現(xiàn)象

表現(xiàn)出卵黃囊面積增加、魚標缺失和體長變短等畸形毒性效應(yīng)。其中在９６ｈｐｆ，對這些??不同表型在所有有效應(yīng)的胚胎和幼魚中所占的比例（圖４－Ｃ）和這些不同表型之間的相??關(guān)性（圖４－ｄ）進行了統(tǒng)計和記錄。其中，９６?ｈｐｆ的斑馬魚幼魚體長統(tǒng)計結(jié)果如圖５－Ｃ??所示。在圖中可以得出，和對照組相比，所有的四環(huán)素濃度處理組都不能顯著改變斑馬??魚幼魚的體長。在２０?ｉｉｇ／Ｌ四環(huán)素的處理組中，體長變短的幼魚占總畸形總數(shù)的５２．５％，??說明，體長發(fā)育是四環(huán)素影響斑馬魚胚胎發(fā)育的主要指標之一。??在孵化方面，對照組中超過９８％的斑馬魚幼魚孵化成功（圖５－ｂ）。和對照組相比，??雖然低濃度四環(huán)素處理組的孵化率并沒有呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系（ｐ＜０．０５），但２００??ｐ＿ｇ／Ｌ以上濃度的四環(huán)素還是顯著的抑制了斑馬魚胚胎的蔣化，其中，２００＾１８／１＾處理組的??孵化率為９０．０?±０．２％超過５００ｔｎｇ／Ｌ后，沒有斑馬魚胚胎可以輝化成功（數(shù)據(jù)未給出）。??另外
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本文編號：2888100