乙烯作為結(jié)構(gòu)最簡單的植物激素,在植物的生長發(fā)育、果蔬的成熟衰老、抗逆反應(yīng)等過程中扮演著重要的角色。其在高等植物中的生理作用、生物合成和分子作用機理已經(jīng)得到了系統(tǒng)深入的研究。食用菌具有高營養(yǎng)和藥用價值,受到消費者的喜愛。然而,相比較高等植物,食用菌中乙烯的產(chǎn)生及作用研究極少。本研究以食用菌中模式材料雙孢菇(Agaricus bisporus Lange Sing)為試材,探討乙烯對子實體生長發(fā)育與采后衰老的影響、乙烯合成途徑及調(diào)控規(guī)律,為解決食用菌采后衰老難題提供理論參考。主要研究結(jié)果如下： 采用氣相色譜法檢測雙孢菇子實體不同生長發(fā)育和采后貯藏時期乙烯釋放量變化。結(jié)果表明,各個時期子實體均能產(chǎn)生乙烯,但生長發(fā)育期產(chǎn)量極低,而在采后貯藏期,乙烯產(chǎn)量隨著子實體繼續(xù)發(fā)育和衰老逐漸增加,分別在子實體剛破膜開傘和釋放孢子初期產(chǎn)生高峰,產(chǎn)量分別為貯藏前的83和209倍,說明乙烯可能參與子實體采后的衰老過程。 采用0.05%乙烯利處理采收時期子實體,研究其對子實體內(nèi)源乙烯和衰老的影響。結(jié)果表明,采后乙烯利處理加速了內(nèi)源乙烯釋放高峰的到來,增加了子實體的開傘率和開傘度,加大了子實體細胞膜滲透率和膜脂過氧化程度,加快了可溶性蛋白、可溶性總糖的降解,同時抑制了子實體抗氧化相關(guān)酶活和物質(zhì)的增加。由此說明,乙烯能夠加速子實體采后的衰老。 采用高等植物乙烯合成前體物質(zhì)L-MET(甲硫氨酸)、SAM(S-腺苷甲硫氨酸)和ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)處理采收時期子實體,發(fā)現(xiàn)乙烯釋放高峰均提前出現(xiàn),并且乙烯產(chǎn)量有了不同程度的增加,而高等植物關(guān)鍵酶ACS (ACC合酶)抑制劑AOA(氨基氧乙酸)、ACO (ACC氧化酶)抑制劑CoCl2和疊氮鈉處理顯著抑制了乙烯釋放量。此外,不僅從子實體中檢測到了ACS和ACO活性、及ACC含量,而且克隆得到了與高等植物中同源的多個乙烯合成元件。我們認為,雙孢菇中至少存在一種途徑與高等植物中乙烯合成途徑相似,即Met→SAM→ACC→乙烯。另外,子實體膨大和采后貯藏時期,ACO酶活的躍變幅度均大于ACS,且乙烯利處理誘導(dǎo)ACO酶活的上升先于ACS酶活的上升,說明ACO可能在雙孢菇乙烯合成途徑中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。 利用實時定量PCR和Western雜交檢測了雙孢菇中乙烯合成相關(guān)元件的表達規(guī)律。結(jié)果表明,子實體生長發(fā)育階段低水平的乙烯合成主要受AbACS2基因的調(diào)控,其他5個基因的表達水平均很低；然而,采后貯藏中乙烯的合成受AbACS1、AbACS2和AbACO三個基因的協(xié)調(diào)控制,且呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的時間表達差異性；此外,采后乙烯利處理誘導(dǎo)貯藏中AbACO基因表達的上升先于AbACS1和AbACS2,且在誘導(dǎo)程度上遠大于AbACSl和AbACS2,具有誘導(dǎo)表達差異性；ACO蛋白隨著子實體采后衰老逐漸累積,在菌褶組織表達最高,具有組織表達差異性。以上說明,雙孢菇中乙烯合成具有類似高等植物的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的調(diào)控。 將雙孢菇AbACO進行序列分析、同源建模、定點突變和動力學(xué)研究,結(jié)果表明,活性中心處第289位氨基酸殘基的不同是導(dǎo)致AbACO與高等植物ACOs底物結(jié)合特性不同的主要原因。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：S646;TS219
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
第一章 立題依據(jù)與文獻綜述
    1.1 課題的研究意義
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析
        1.2.1 雙孢菇采后生理生化研究進展
        1.2.2 乙烯與果蔬的成熟衰老研究進展
        1.2.3 不同進化程度生物中乙烯合成途徑研究進展
    1.3 研究目標和研究內(nèi)容
        1.3.1 研究目標
        1.3.2 研究內(nèi)容
第二章 雙孢菇子實體中乙烯產(chǎn)生的規(guī)律及采后乙烯利處理對其衰老的影響
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 處理方法
        2.2.3 主要化學(xué)試劑
        2.2.4 主要實驗儀器
        2.2.5 實驗方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 生長發(fā)育階段雙孢菇子實體中乙烯釋放的規(guī)律
        2.3.2 雙孢菇采后貯藏時期子實體中乙烯釋放的規(guī)律
        2.3.3 采后乙烯利處理對雙孢菇子實體貯藏期間衰老的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 雙孢菇子實體中乙烯生物合成途徑的探究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 處理方法
        3.2.3 主要化學(xué)試劑及配置方法
        3.2.4 主要實驗儀器
        3.2.5 實驗方法
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 基于三種已知乙烯生物合成途徑初步明確雙孢菇子實體中的乙烯合成途徑
        3.3.2 雙孢菇子實體生長發(fā)育階段和采后貯藏中ACS和ACO活性、ACC含量的變化規(guī)律
        3.3.3 采后乙烯利處理對雙孢菇子實體貯藏期間ACS和ACO活性、ACC含量的影響
        3.3.4 高等植物中乙烯合成關(guān)鍵酶抑制劑處理對雙孢菇子實體貯藏期間ACS和ACO活性的影響
        3.3.5 雙孢菇子實體中乙烯合成的類高等植物ACC途徑相關(guān)基因的克隆
    3.4 討論
    3.5 結(jié)論
第四章 雙孢菇子實體中乙烯合成類ACC途徑相關(guān)元件的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平調(diào)控
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 處理方法
        4.2.3 載體
        4.2.4 主要化學(xué)試劑
        4.2.5 主要溶液配制
        4.2.6 主要實驗儀器
        4.2.7 實驗方法
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 雙孢菇子實體中乙烯合成的類ACC途徑在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控
        4.3.2 雙孢菇子實體中ACO蛋白的組織、時間和誘導(dǎo)表達模式
    4.4 討論
    4.5 結(jié)論
第五章 雙孢菇子實體中ACO蛋白的功能鑒定和活性位點分析
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 表達載體
        5.2.3 主要試劑
        5.2.4 主要溶液配制
        5.2.5 主要實驗儀器
        5.2.6 實驗方法
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 重組AbACO蛋白的制備
        5.3.2 AbACO氨基酸序列與植物中ACOs氨基酸序列的比對
        5.3.3 AbACO蛋白的結(jié)構(gòu)模擬及定點突變
2+的親和性'>        5.3.5 光譜分析確定AbACO蛋白對Fe²⁺的親和性
2+的親和性'>        5.3.6 光譜分析確定AbACO蛋白對Co²⁺的親和性
    5.4 討論
    5.5 結(jié)論
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
致謝
個人簡介

【參考文獻】

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