【摘要】：棉花不僅是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物,也是紡織工業(yè)的重要原料和戰(zhàn)略物資。棉花纖維細(xì)胞是一種易于分離且較長的植物細(xì)胞,其細(xì)胞次生壁90%以上的成分為纖維素,因此,棉花纖維也被作為一種研究植物細(xì)胞伸長、細(xì)胞壁建成以及纖維素生物合成的模型之一。棉花纖維是由胚珠(種子)外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)分化起始、伸長(初生壁合成)、增厚(次生壁合成)以及脫水成熟等過程發(fā)育而成的單細(xì)胞表皮毛。其中,纖維細(xì)胞的起始決定了最終纖維的數(shù)量,纖維細(xì)胞的伸長決定了成熟細(xì)胞的長度,次生壁合成決定了纖維的強(qiáng)度。因此,克隆棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因并解析其基因產(chǎn)物的功能及分子調(diào)控機(jī)制不僅具有重要的理論意義,而且對提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的應(yīng)用價值。本實驗室從棉花中分離了26個NAC基因家族成員(cDNA),分別命名為GhNACl-26。本文對其中一個NAC轉(zhuǎn)錄因子(GhNAC1)在棉纖維次生壁加厚過程中的功能進(jìn)行了研究。此外,本文也對一個編碼棉花絲裂原活化蛋白激酶的GhMPK17基因進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：1. GhNAC1在棉纖維發(fā)育過程中的表達(dá)分析GhNAC1與擬南芥中NST1、NST2以及SND1(NST3)的同源性較高,且基因結(jié)構(gòu)類似。通過qRT-PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),除了在下胚軸中具有微弱的表達(dá)外,GhNAC1在棉纖維發(fā)育的次生壁加厚初期優(yōu)勢表達(dá),且隨著纖維發(fā)育該基因表達(dá)量逐漸升高,至開花后20天其在纖維中的表達(dá)量達(dá)到峰值。GhNAC1啟動子表達(dá)模式與其組織表達(dá)情況也較為一致。另外,GhNAC2在伸長和次生壁加厚期的棉纖維中特異表達(dá),其在纖維中的表達(dá)譜與GhNAC1類似。2. GhNAC1過量表達(dá)對棉纖維次生壁發(fā)育的影響為了探究GhNAC1在棉纖維發(fā)育中的功能,構(gòu)建了GhNAC1過量表達(dá)載體(GhNAC1OE)和RNA干擾(RNAi)載體,轉(zhuǎn)化棉花,獲得大量轉(zhuǎn)基因棉花植株。通過組織切片、觀察統(tǒng)計、X射線衍射、GC-MS等方法分析發(fā)現(xiàn),在GhNAC1過量表達(dá)的情況下,棉花葉柄木質(zhì)部細(xì)胞中木質(zhì)素與纖維素含量增多,且在皮層以及髓細(xì)胞中出現(xiàn)了異位沉積的現(xiàn)象,棉纖維長度變短,細(xì)胞壁增厚,纖維素結(jié)晶度增加,不同發(fā)育時期的棉纖維細(xì)胞壁中的單糖組分含量發(fā)生改變。有關(guān)RNAi轉(zhuǎn)基因棉花的表型及遺傳等方面的分析正在進(jìn)行中。3. GhNACl轉(zhuǎn)錄因子驗證及其互作蛋白分析亞細(xì)胞定位及酵母自激活實驗證實,GhNAC1及GhNAC2均屬于轉(zhuǎn)錄因子家族成員。利用酵母雙雜交技術(shù),以GhNAC1 (NAC domain)為“誘餌”,在棉纖維cDNA文庫中篩選互作蛋白。對篩選結(jié)果中感興趣的蛋白重復(fù)酵母雙雜交實驗,發(fā)現(xiàn)GhNAC1蛋白之間能夠形成同源二聚體,且具有較強(qiáng)的相互作用能力。GhNAC1與GhNAC2以及泛素-蛋白酶體途徑中的E2泛素化接合酶之間也能夠發(fā)生結(jié)合,但它們之間的相互作用較弱。另外,pull-down實驗進(jìn)一步證實GhNAC1在體外也能夠形成同源二聚體。4. GhNACl蛋白降解途徑分析文獻(xiàn)報道,NAC轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后調(diào)控,其轉(zhuǎn)錄水平的高低主要受到miRNA的控制,而翻譯水平的調(diào)控則依賴于泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑以及某些酶類的修飾來完成。通過觀察不同處理條件下GhNAC1-eGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥中的熒光數(shù)量及強(qiáng)度,初步判斷其蛋白的降解與蛋白酶體有關(guān)。RNA、蛋白質(zhì)的半定量實驗進(jìn)一步證實了上述判斷,免疫沉淀的結(jié)果則為GhNAC1蛋白被打上泛素化標(biāo)簽提供了直接的證據(jù)。基于上述原因,在翻譯后水平,GhNAC1有可能是通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解的。5. GhNACl自調(diào)控分析利用35S::GhNAC1和GhNAClp::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行雜交,對F2代的陽性雜交株以及GhNAC1p::GUSS轉(zhuǎn)基因植株的2周小苗和6周成苗進(jìn)行GUS染色后發(fā)現(xiàn),無論正交或是反交,在GhNACl過量表達(dá)的情況下,GUS信號出現(xiàn)的強(qiáng)度和范圍均有所增強(qiáng)和增大。實時定量PCR實驗也證實,雜交株中GUS表達(dá)量要高于轉(zhuǎn)基因株系。另外凝膠遷移阻滯實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)的結(jié)果顯示GhNAC1能夠結(jié)合在自己的啟動子上。上述實驗表明,GhNAC1可能對自身產(chǎn)生一個正向的調(diào)控作用。6. GhNACl對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析為了研究GhNAC1轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的調(diào)控,分離克隆了12個可能位于GhNAC1下游的目標(biāo)基因的啟動子序列。借鑒以往報道的擬南芥中能夠與SND1發(fā)生結(jié)合的順式作用元件的基序,利用EMSA技術(shù),找到了一些受GhNACl直接調(diào)控的靶標(biāo)基因,這些基因不僅包括上游的轉(zhuǎn)錄因子,而且含有下游參與細(xì)胞壁建成和修飾的功能基因,進(jìn)而總結(jié)出了能夠與GhNAC1發(fā)生結(jié)合的順式作用元件的序列集合——一段具有13個堿基的不完全回文序列,并對GhNAC1的下游基因,尤其是與纖維素合成相關(guān)的基因在GhNAC1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。RNAi轉(zhuǎn)基因植株中的基因表達(dá)情況以及進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析正在進(jìn)行中。7. GhMPK17基因克隆鑒定及功能研究從棉花cDNA文庫中分離了一個編碼絲裂原活化蛋白激酶的基因,并將其命名為GhMPK17。實時定量PCR分析表明,在NaCl、甘露醇及ABA處理后,GhMPK17在棉花中的表達(dá)量上升。而且,與野生型擬南芥相比,過量表達(dá)GhMPK17的轉(zhuǎn)基因擬南芥在NaCl、甘露醇及外源ABA脅迫的條件下顯示出更高的種子萌發(fā)率、根伸長率和子葉綠葉率,這暗示過量表達(dá)GhMPK17能夠減弱擬南芥對ABA的敏感性,增強(qiáng)植株對鹽和滲透脅迫的抗性。進(jìn)一步研究表明,過量表達(dá)GhMPK17能夠減少擬南芥中H202含量,導(dǎo)致植株中ABA及非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。綜上所述,GhMPK17可能參與棉花對非生物脅迫應(yīng)答及ABA信號通路。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S562

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本文編號：2792223