【摘要】：油桐是中國(guó)所特有的經(jīng)濟(jì)林木,同時(shí)也是世界上著名的工業(yè)用油樹(shù)種,還被稱為我國(guó)四大木本油料樹(shù)種之一。桐油的脂肪酸主要由桐酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸等組成,其中桐酸的含量最高,達(dá)70%以上,是一種優(yōu)質(zhì)的工業(yè)使用油。在油桐種子脂肪酸生物合成代謝的過(guò)程中,包括一系列調(diào)控生理生化代謝過(guò)程的酶和基因,其中包含最主要的FAS和FAE兩個(gè)復(fù)合酶系統(tǒng)。本研究是以油桐‘葡萄桐’品種不同發(fā)育時(shí)期種子為材料,在已構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上,對(duì)FAS中油桐KAR基因進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA克隆和功能研究,從而對(duì)油桐脂肪酸生物合成途徑和油桐及油料樹(shù)種的遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：1、油桐KAR基因的克隆及生物信息學(xué)分析。以油桐‘葡萄桐’品種成熟種子為材料,采用普通PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆獲得油桐β-酮脂酰-ACP還原酶KAR基因家族的兩個(gè)成員,并將其分別命名為Vf_KAR1和Vf_KAR2 (GenBank登錄號(hào)：KF025646, KF025647)。Vf_KAR1和Vf_KAR2的ORF長(zhǎng)度分別為993bp和903bp,所編碼的蛋白質(zhì)分子量分別為35kD和32kD,等電點(diǎn)分別為9.28和9.11,綜合Vf_KAR1和Vf_KAR2的脂肪系數(shù)與總平均親水性來(lái)分析可推測(cè)兩基因編碼的蛋白都為疏水性蛋白。KAR氨基酸Vf_KAR1存在1個(gè)跨膜域和1個(gè)疑似跨膜域,Vf_KAR存在2個(gè)疑似跨膜域。Vf_KAR1和Vf_KAR2都含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和多個(gè)活性位點(diǎn)、NAD(P)結(jié)合位點(diǎn),Vf_KAR1蛋白序列的90aa-256aa和Vf_KAR2蛋白序的59aa～225aa都是短鏈脫氫還原酶蛋白的保守區(qū)域,屬于短鏈脫氫酶還原酶(SDR)家庭成員。Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白的二、三級(jí)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它們主要以α螺旋和β折疊為主,它們的結(jié)構(gòu)中心由兩個(gè)右手螺旋的βaβaβmotif組成。Vf_KAR1和Vf_KAR1氨基酸序列與其他物種的同源性在62～82%之間,Vf_KAR1和Vf_KAR1相似性僅有74%。綜合以上生物信息學(xué)分析可推斷Vf_KAR1和Vf_KAR1確為油桐KAR基因家族的兩個(gè)成員。2、油桐KAR基因在油桐不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)存在差異。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化的體系進(jìn)行qRT-PCR,檢測(cè)Vf_KAR1和Vf_KAR2在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期種子的表達(dá)模式。Vf_KAR1和Vf_KAR2在油桐12個(gè)不同組織中都有表達(dá),這結(jié)果與其他植物相同,但Vf_KAR1主要是在種仁中表達(dá),Vf_KAR2主要在莖和葉片中表達(dá),這可能與Vf_KAR1和Vf_KAR2發(fā)揮的作用有關(guān)。Vf_KAR1基因在油桐種子9個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律與油桐種子內(nèi)油脂合成成正相關(guān),在種子發(fā)育到7月的表達(dá)量較低,但到種子發(fā)育的8月初至9月初則具有較高的表達(dá)量,10月后由于種子逐近成熟,油脂合成代謝開(kāi)始減弱,Vf_KAR1的表達(dá)量也開(kāi)始減少,由此可知Vf_KAR1基因參與油桐種子油脂生物合成,并發(fā)揮著重要作用,而Vf_KAR1在種子整個(gè)發(fā)育時(shí)的表達(dá)量都較低且沒(méi)有多大差異。3、油桐KAR蛋白亞細(xì)胞定位于煙草葉片葉綠體中。根據(jù)農(nóng)桿菌侵染煙草葉瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白都定位于煙草葉片葉綠體中,這些結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致,這可能與Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白序列中存在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽有關(guān)系。4、油桐KAR家族Vf_KAR2和Vf_KAR1蛋白之間的互作關(guān)系分析。采用Gateway技術(shù),構(gòu)建了pDEST32-Vf_KAR1、pDEST22-Vf_KAR1、pDEST32-Vf_KAR1、pDEST22-Vf_KAR2酵母表達(dá)載體并將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒成功的共轉(zhuǎn)化到Mav203酵母中,確定了pDEST32-Vf_KAR1×pDEST22-Vf_KAR2 和 pDEST32-Vf_KAR2×pDEST22-Vf_KAR1雙質(zhì)粒的二倍體酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的3AT濃度為25mM, pDEST32-Vf_KAR1×pDEST22和pDEST32-Vf_KAR2×pDEST22雙質(zhì)粒的二倍體酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的3AT濃度為20mM。通過(guò)觀察雙質(zhì)粒的二倍體酵母細(xì)胞生長(zhǎng)在三缺培養(yǎng)基SC-Leu-Try-Ura和X-gal顯色反應(yīng)分析,Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白之間沒(méi)有互作關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S794.3
【圖文】：

只是每一種憸基均ＬＪ憸基－ＣｏＡ的形式參加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成過(guò)程中延逡逑長(zhǎng)的憸基碳鏈由ＣｏＡ攜帶及中鏈或長(zhǎng)鏈憸基－ＣｏＡ代替乙憸－ＣｏＡ參與反應(yīng)Ｐｓ’Ｍｌ，逡逑其具體的超長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成途徑見(jiàn)圖１．２。逡逑Ｉ邋ＣｎＩ逡逑Ｉ丙二度單巧ＣＯＡ逡逑邐邐＞￣｜邋ＣｎＢｓ邋聯(lián)邋ＣｏＡ邐＼逡逑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逡逑Ｉ邋口－巧月旨巧ＣｏＡ—Ｉ邐Ｃ＾ＡＤＰＨ＾邐Ｉ目－巧臘�。�0Ａ￣｜逡逑、邐■￣￣Ｉ邋ｅ邋－居巧ｃ0＾￣ｈ＾逡逑圖１．２超長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成途徑逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｖｅｉｙ邋ｌｏｎｇ邋ｃｈａｉｎ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑８逡逑

邋ｙ逡逑筋酶一＾逡逑圖１．１植物短鏈和中長(zhǎng)鏈脂肪酸的生物合成代謝逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｐｌａｎｔ邋ｓｈｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｌｏｎｇ邋ｃｈａｉｎ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏ巧Ｍｈｅｓｉｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑１．２．２．２植物超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成代謝逡逑植物超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成系統(tǒng)主要是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成，Ｗ丙二酸單憸－ＣｏＡ逡逑為二碳單元供體，在脂肪酸延伸酶（Ｆａｔｔｙ邋Ａｃｉｄ邋Ｅｌｏｎｇａｓｅ，ＦＡＥ）復(fù)合體的催化作用下逡逑將碳１８脂肪酸的延伸為碳２０或者更長(zhǎng)碳鏈的脂肪酸ｔｗ’ｉｅｉｎＦＡＥ屬于膜綁定多酶逡逑復(fù)合體，它主要由４種酶組成，分別是（３－麗醋憸－ＣｏＡ合酶（（３－ｋｅｔｏａ巧１－ＣｏＡ巧ｎｔｈａｓｅ，逡逑ＫＣＳ）［７１］、（３－麗脂憸邋ＣｏＡ邋還原酶（Ｐ－ｋｅｔｏａ巧Ｉ－Ｃ０Ａ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，邋ＫＣＲ）［７２］，邋ｐ－哲憸－ＣｏＡ逡逑脫水酶（Ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡｄｅｈｙ邋ｄｒａｔａｓｅ，邋ＨＣＤ）ｔ７３ｌ邋和賭脂憸邋ＣｏＡ邋還原酶逡逑（Ｔｒａｎｓ－２，３－ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＥＣＲ）Ｐ４１。超長(zhǎng)鏈脂肪酸的生物合成過(guò)程主要有四逡逑個(gè)反應(yīng)

經(jīng)在多種細(xì)茵、植物和頂口原蟲(chóng)等多種生物中發(fā)現(xiàn)了扮？基因的存在。他們屬于逡逑短鏈脫氨酶還原酶（ＳＤＲ）的酶家族，家族有一個(gè)特別保守的ａ／ｐ折疊，折疊與逡逑折疊中存在Ｒｏｓｓｍａｎ形式ｔＷ。根據(jù)比較分析Ｅｃｏ／ｚ？洰？（圖１．３Ａ巧日公ｍｓｊｋａ逡逑ｎｆｌb6Ｊc浫紓福矗常ㄍ跡保福┑牡ヌ褰峁狗⑾置扛齙ヌ逵桑犯觶姓鄣停父觶崧菪�，辶x轄峁怪幸燦閃礁鲇沂鄭校幔穡嶧潁ǎ恚錚簦椋媯┳槌桑桓鲇桑穡�，７w埠停穡沖澹準(zhǔn)埃幔歟澹幔插義獻(xiàn)槌�，另一个是由７w�，邋７w島停穡隊(duì)耄ǎ�，邋ａ５组成，ａｊ愝旋邦侊喗庚}蛄釉諞誨義掀稹＃幔�，邋ａ７芯暽一个特殊的基袧}虢峁怪幸�。ａＺM耄埃叮澹校妨櫻鞍漬鄣義現(xiàn)罩褂冢幔��；罨幸踩澹ǎ櫻澹潁裕潁蹋螅┚奐諞黃穡揮讜冢校擔(dān)幔擔(dān)返母澆義希裕潁歟擔(dān)焙停蹋螅歟擔(dān)搗植莢冢幔德菪�，而彦}歟常肝揮冢校島停幔敵緯傻幕飛�。辶x希瑰義

本文編號(hào)：2789564