【摘要】： 奧奈達希瓦氏菌(Shewanella onedensis:S.onedensis)具有代謝方式的多樣性和靈活性,是生物修復與生物進化領域研究的模式菌株。因為希瓦氏菌對不溶性金屬的還原性,以及在生物燃料電池等方面潛在的應用前景,使得希瓦氏菌生物膜的研究成為近年來該領域研究的熱點。已報道的文獻對該菌在固體表面形成生物膜的研究較多,但在氣液界面形成生物膜的研究未見報道。 本論文首次構建了Shewanella onedensis MR-1靜置培養(yǎng)條件下形成氣液界面生物膜的生長體系,結合微生物生理學、生物化學與分子生物學的研究方法對氣液界面生物膜形成的條件、必需因素和分子機制進行了較系統(tǒng)的研究。主要取得了以下結論和認識: (1)構建MR-1氣液界面生物膜生長的培養(yǎng)體系,探討該生物膜生長的動力學和生長特征。 研究了靜置培養(yǎng)生長時氣液界面生物膜的生長動力學和培養(yǎng)體系的氧氣條件等生長特征。實驗表明氣液界面生物膜僅在好氧條件下形成,且形成生物膜時浮游細胞的臨界濃度(OD_(600))為0.23,浮游細胞濃度(OD_(600))超過0.23后,細胞開始粘附到氣—固—液界面,然后擴展到氣-液交界面成膜。在厭氧靜置培養(yǎng)時,即使浮游細胞密度(OD_(600))達到0.4,液體表面也沒有觀察到生物膜的形成,說明氧氣條件和一定濃度的浮游細胞是氣液界面生物膜形成的重要條件。 (2)研究胞外基質(zhì)的主要成分,觀察生物膜的微觀形貌特點。 胞外基質(zhì)是生物膜的重要組成部分,一般包括蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等組分。本文實驗發(fā)現(xiàn),大于100μg/mL的蛋白酶K不僅能阻止生物膜的形成,而且可以破壞生長成熟的生物膜。而DNaseⅠ(0-1000U/mL)和纖維素酶(0-100U/mL)對生物膜的形成沒有影響,也不能破壞成熟的生物膜。說明而纖維素和DNA不是生物膜基質(zhì)中的主要成分,蛋白質(zhì)對生物膜形成與穩(wěn)定有重要作用。所以,淪文對蛋白分泌系統(tǒng)及其分泌的蛋白進行了進一步的研究。SEM分析顯示成熟的MR-1氣液界面生物膜是由多層密集細胞組成,膜上細胞從頂端產(chǎn)生直徑約10nm,幾到幾十微米長的納米線。 (3)應用MR-1全基因組cDNA芯片,揭示同一培養(yǎng)體系中氣液界面生物膜與浮游細胞表達的各種差異。 為了研究氣液界面生物膜與浮游細胞的差異和生物膜形成的機理,文章利用MR-1全基因組cDNA芯片研究了同一培養(yǎng)系統(tǒng)中氣液界面生物膜與浮游細胞表達的差異。芯片分析結果表明:1)浮游細胞與氣液界面生物膜細胞表達差異的基因涉及MR-1生理代謝的各個方面,占總編碼序列的19.0%;2)在生物膜細胞中,所有三羧酸循環(huán)基因和ATP合成酶基因都上調(diào),13個編碼NADH脫氫酶的基因有12個上調(diào);與厭氧呼吸有關的基因在浮游細胞中表達上調(diào);說明氣液界面生物膜細胞是以有氧呼吸為主,浮游細胞以厭氧呼吸為主;(3)蛋白運輸基因在兩種細胞中表達差異顯著,特別是鐵與血紅素吸收與運輸?shù)幕蛟谏锬ぶ幸恢律险{(diào),采用q-RT-PCR驗證了芯片雜交實驗的可靠性,說明鐵在生物膜的形成過程中有某種程度的作用。 (4)系統(tǒng)研究了EDTA和Fe、Ca、Mn、Cu、Zn、Mg等金屬離子分別對MR-1氣液界面生物膜形成的影響 首先,構建了△hmuT和△hugA兩株鐵運輸基因突變株,發(fā)現(xiàn)突變株與野生株形成氣液界面生物膜的能力一樣;說明鐵對MR-1生物膜形成貢獻較小,cDNA芯片識別的鐵運輸基因不是與生物膜的形成功能特異性相關,它們的表達差異是對氣液界面生物膜生成環(huán)境的適應性響應。 其次,研究了EDTA和其它金屬離子對氣液界面生物膜形成的作用。實驗發(fā)現(xiàn):0.3mM EDTA完全抑制了生物膜的生成;大于0.3mM Ca(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)能完全消除EDTA對生物膜形成的抑制;而Mg(Ⅱ)加入含EDTA的培養(yǎng)液不能恢復生物膜的形成;說明前四種金屬離子在生物膜形成中有重要的促進作用。0.3mM Fe(Ⅱ)或Fe(Ⅲ)加入含EDTA的培養(yǎng)液,MR-1生物膜形成量僅為沒有EDTA處理的42.5%和40.8%,進一步驗證了鐵對MR-1生物膜形成貢獻較小。 (5)探討與生物膜形成相關的蛋白及其分泌通道 首先,采用RT-PCR對MR-1基因組中依次排列的rtxB、emrA、aggA和ompA基因轉錄關系進行分析,結果表明它們同屬于rtxB操縱子。利用生物信息學的方法對rtxB操縱子的可能啟動子序列進行了預測和分析。其次采用基因同源重組方法構建了Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)三個基因的突變株△rtB,△emrA和△aggA,分泌系統(tǒng)上游基因突變株△rtx,下游基因突變株△ompA。 實驗表明:△rtx,△rtxB,△emrA和△aggA四株突變株都喪失了在氣液界面形成生物膜的能力,它們在固體表面生成生物膜的速率比野生株慢,說明Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)及其上游Rtx毒素蛋白與氣液界面生物膜形成相互關聯(lián)。在生物膜形成、上清液互補、群集運動、SEM等分析中△rtx突變株與Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)突變株表型高度一致,說明Rtx毒素蛋白通過Ⅰ型蛋白分泌系統(tǒng)分泌至胞外,促使生物膜的形成。 最后,建立了Rtx毒素蛋白通過Ⅰ型分泌系統(tǒng)分泌到膜外,與Ca~(2+)結合導致細胞間的連接和成膜的模型。 (6)研究c型細胞色素對氣液界面生物膜形成的影響和機制 c型細胞色素是電子傳遞鏈上重要組分,對其研究主要集中在厭氧呼吸系統(tǒng),研究其對氣液界面生物膜的影響有助于探明生物膜的形成機理。研究了12株c型細胞色素突變株對氣液界面生物膜形成的影響。首次研究并發(fā)現(xiàn)△SO4666完全喪失了成膜能力;△SO1777,△SO1782,△S02361和△SO2363成能力下降。研究了12株c型細胞色素突變株在生物膜細胞和浮游細胞中的競爭生長。生物膜細胞或浮游細胞競爭生長后,△SO1777,△SO1782,△SO2361和△SO2363四株菌的細胞數(shù)量都減少,說明它們通過影響靜置生長時浮游細胞的生長速度影響生物膜的形成。掃描電鏡觀察喪失成膜能力的△SO4666突變株表面結構,發(fā)現(xiàn)細胞表面納米線缺失;△SO4666變株群集運動能力比野生株弱;說明△SO4666突變株由于納米線的缺失,導致群集運動能力降低以及氣液界面生物膜形成能力的喪失,納米線是MR-1菌株氣液界面生物膜形成必需的元素。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：X703
【圖文】：

科技工作者利用不同的方法研究了金屬離子在生物膜中的存在形式和作用機理，試圖運用各種化學的、生物的理論，從細胞和分子層面來解釋生物膜與金屬的相互作用〔’7〕(圖1一3)。金屬離子與細胞或其分泌物質(zhì)結合，在生物膜中的存在方式主要有以下幾類:(l)生物膜胞外基質(zhì)。多糖、蛋白質(zhì)、 DNA以及它們的單體作為細菌生物膜胞外聚合基質(zhì)的主要組分，它們通過帶負電核的輕基，梭基，琉基等，和金屬元素通過相反電荷間的靜電相互作用、甚至是成鍵作用緊密結合，穩(wěn)定生物膜的結構〔川。(2)細菌表面結構。細胞膜與細胞壁能提供許多離子結合位點與金屬離子結合，例如細胞壁上脂肪酸糖脂「以2:l]。(3)細菌代謝終產(chǎn)物。微生物的很多代謝終產(chǎn)物可以與金屬離子反應，產(chǎn)生金屬沉淀復合物，如硫化物或碳酸鹽;散布在活細胞間的死亡細胞是生物膜中容易被忽視的組份〔‘了〕，它具有化學反應活性，能夠提供沉淀或絡合金屬的位點;另外

C偽栩扭咖助容爪mSu揚蕊側叨的圖1一2成熟細菌生物膜的結構Fig.l一 2Maturebiofilmstructureeontaininglayers， ineludingbulkofbiofilm，linkingfilm， eonditioningfilm， andthesubstratumtowhiehthefilm15attached. 1.2.2金屬離子對生物膜形成的作用機理近年來，科技工作者利用不同的方法研究了金屬離子在生物膜中的存在形式和作用機理，試圖運用各種化學的、生物的理論，從細胞和分子層面來解釋生物膜與金屬的相互作用〔’7〕(圖1一3)。金屬離子與細胞或其分泌物質(zhì)結合，在生物膜中的存在方式主要有以下幾類:(l)生物膜胞外基質(zhì)。多糖、蛋白質(zhì)、 DNA以及它們的單體作為細菌生物膜胞外聚合基質(zhì)的主要組分

革蘭氏陽性菌通常通過專一的ABC(ATPbindingCaSSette)蛋白分泌膚信號分子，膚信號分子被同源雙組分轉導信號的感應激酶蛋白分子識別，與胞漿反應調(diào)節(jié)蛋白相互作用，產(chǎn)生磷酸化與去磷酸化的系列反應而誘導相關基因的表達。葡萄球菌群體感應系統(tǒng)中的輔助基因調(diào)節(jié)因子能被膚信號分子激活，調(diào)控數(shù)種細菌蛋白的表達，增強多種毒力因子的分泌，影響生物被膜生長和發(fā)展[45〕LuxS依賴的群體感應信號在細菌生物被膜形成過程中起重要的作用。在鏈球菌突變體研究中發(fā)現(xiàn)了以又交變株形成的生物膜結構發(fā)生了改變，質(zhì)地粗糙，基質(zhì)間間隙增大，呈現(xiàn)顆粒狀外觀〔側。細菌群體感應系統(tǒng)，使作為單細胞生物的細菌具備了部分類似多細胞生物的功能，讓細菌在應對環(huán)境挑戰(zhàn)時，能協(xié)調(diào)一致，以群體的力量共同完成一些單個或浮游狀細菌無法完成的功能。影響生物膜結構的因素很多，包括水力學條件、胞外多聚物的數(shù)量，細菌的移動性以及金屬離子的種類和濃度等等，細菌群

【引證文獻】

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1 蘇艷;段繼周;段東霞;藺存國;張杰;侯保榮;楊東方;;材料表面性質(zhì)對微生物附著行為的影響[J];海洋科學;2012年12期

相關碩士學位論文 前1條

1 蘇艷;海洋生物附著過程與防污評價技術的研究[D];上海海洋大學;2012年

本文編號：2768738