【摘要】：多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是在環(huán)境中廣泛存在的一類具有難降解性,致畸性,致癌性以及致突變性的有機(jī)污染物(Persistant Organic Pollutants,POPs)。該類有機(jī)污染物可長期積累并存在于土壤環(huán)境中,對土壤的生態(tài)功能,農(nóng)作物的生產(chǎn)質(zhì)量以及人類的健康具有嚴(yán)重的危害。因此,修復(fù)土壤多環(huán)芳烴的污染,保護(hù)土壤環(huán)境安全,并且可持續(xù)利用土壤資源是當(dāng)前各國關(guān)注的熱點(diǎn)。生物修復(fù)當(dāng)今最具潛力而且對環(huán)境破壞最小的土壤修復(fù)技術(shù)之一,是利用植物與微生物的協(xié)同作用降解有毒有機(jī)污染物的多元復(fù)合修復(fù)技術(shù)。豆科植物——根瘤菌共生體系具有生物固氮的功能,在有機(jī)污染土壤中碳素含量過高,氮素相對缺乏的情況下,利用該生物共生體系對污染土壤修復(fù)具有積極意義。因此,研究豆科植物——根瘤菌共生體系修復(fù)多環(huán)芳烴在根際環(huán)境中的降解作用機(jī)理以及其根際響應(yīng)機(jī)制,可以為制定高效實(shí)用的土壤多環(huán)芳烴污染修復(fù)技術(shù)提供基礎(chǔ)性的研究數(shù)據(jù)和針對性的防治辦法。本文選擇菲(PHE)和芘(PYR)為代表性的多環(huán)芳烴,從多環(huán)芳烴降解菌的篩選,降解基因的擴(kuò)增與鑒定,降解菌對多環(huán)芳烴的降解率測定,根際微生物結(jié)構(gòu)分析、根系分泌物的作用等多角度開展了豆科植物豇豆修復(fù)PHE污染土壤的根際響應(yīng)機(jī)制研究;采用植物實(shí)驗(yàn)結(jié)合PCR技術(shù)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和磷酸脂肪酸分析(PLFA)技術(shù)等分析不同根系微域的菌群變化。采用高壓液相色譜(HPLC)和放射性同位素衰變技術(shù)分析多環(huán)芳烴PHE的降解及礦化速率。主要研究結(jié)果如下:(1)在高效PAHs降解菌的篩選試驗(yàn)中,通過對長期污染土壤中的菌群進(jìn)行多環(huán)芳烴PHE、PYR的液體富集培養(yǎng),通過初篩復(fù)篩得到111株P(guān)HE、PYR降解菌。其中有43株可降解PHE,15株可降解PYR,27株P(guān)HE和PYR都能降解,14株可在PHE平板生長,但沒有降解圈,3株可在PYR平板生長沒有降解圈,9株可以在PHE、PYR平板同時(shí)生長但也沒有降解圈。從111株降解菌中挑選42株代表菌進(jìn)行ERIC-PCR,對其指紋圖譜進(jìn)行聚類分析,共聚成10大類群。(2)在鑒定高效多環(huán)芳烴降解菌及降解基因試驗(yàn)中,對從長期污染土壤中篩選得到的17株代表菌進(jìn)行測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果證明17株菌分別聚成7大類群,從七大類群中各選出一株代表菌株進(jìn)行研究,確定了七株代表菌的分類地位,這七株菌分別命名為Mycobacterium vanbaalenii USACA0001-A3,Mycobacterium gilvum USACA0002-B4,Pseudonocardia carboxydivorans USACA0003-C9,Delftia tsuruhatensis USACA0004-D17,Achromobacter xylosoxidans USACA0005-E1,Pseudomonas aeruginosa USACA0006-F15,Bacillus cereus USACA0007-G6。利用已報(bào)道的降解基因的引物進(jìn)行同源擴(kuò)增,分別從Delftia tsuruhatensis USACA0004-D17、Pseudonocardia carboxydivorans USACA0003-C9中獲得多環(huán)芳烴雙加氧酶基因。序列分析表明,D17的降解基因片段(721bp)與Pseudomonas putida所編碼的雙加氧酶metapyrocatachase catechol 23-dioxygenase具有100%的相似度。C9同源擴(kuò)增的多環(huán)芳烴降解基因(320bp)與Nocardioides sp.的編碼鐵硫蛋白大小亞基的phd A,phd B基因具有98%的相似度。本文為首次研究C9 Pseudonocardia carboxydivorans和D17 Delftia tsuruhatensis的PAHs降解基因。(3)在高效多環(huán)芳烴降解菌的篩選及降解率分析試驗(yàn)中,通過平板升華法對7大類群中的代表菌株進(jìn)行降解率初步測定,形成透明圈的速率為:D17A3C9B4E1F15G6。通過比較降解速率,從中選擇3株降解率最高的菌株A3、C9、D17通過液體培養(yǎng)法,采用高效液相色譜法HPLC技術(shù)對該菌株P(guān)HE降解率進(jìn)行研究。結(jié)果表明,在30℃震蕩液體培養(yǎng)條件下,菌株D17在72 h內(nèi)對100 mg/L的PHE降解率為94.4%。A3、C9的降解率分別為85.5%,81.4%。菌株D17的最適生長條件為30℃,p H=7.0。(4)在實(shí)驗(yàn)室新污染土壤與實(shí)際情況下長期污染土壤對于多環(huán)芳烴生物修復(fù)過程差異效應(yīng)的對比試驗(yàn)中,選擇7種典型的PAHs(Naphthalene,Phenanthrene,Pyrene,Acenaphthene,Anthracene,Chrysene,Benzo[α]pyrene)作為目標(biāo)污染物,選擇長期污染土壤HS和新污染土壤NS作為研究對象,通過富集馴化培養(yǎng),運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù),對比長期污染土壤和新污染土壤中7種不同PAHs降解菌群的差異和變化,同時(shí)跟蹤測定降解菌群生物表面活性劑產(chǎn)生情況。結(jié)果表明,在不同的PAHs處理下,長期污染土壤HS較新污染土壤NS表現(xiàn)出更高的菌群的多樣性。通過PCR對BPHD Biphenyl dioxygenases進(jìn)行同源擴(kuò)增,在HS7,HS8,NS7,NS8處理中成功擴(kuò)增出目的序列,其同源性與Rhodococcus sp.編碼的biphenyl 2,3-dioxygenase alpha亞基的(bph A1)基因相似度為98%。對富集培養(yǎng)發(fā)酵液中的生物表面活性劑進(jìn)行提取純化,并對其水溶液的表面張力進(jìn)行測定。最低的表面張力為32.5m N m-1。微生物菌群利用高環(huán)PAHs如B[α]p和混合PAHs的過程中,可以產(chǎn)生生物表面活性劑以促進(jìn)高環(huán)PAHs的吸收降解。(5)在優(yōu)勢豆科植物——根瘤菌共生體系篩選試驗(yàn)中,選用九種代表性的豆科植物做為生物聯(lián)合修復(fù)研究對象,測定其在石油污染土壤、多環(huán)芳烴污染土壤中的耐受性生存率、生物量、結(jié)瘤數(shù)等指標(biāo),豇豆在高濃度有機(jī)污染處理中表現(xiàn)出了較高的生存率和結(jié)瘤量,較其他豆科植物表現(xiàn)出了較高的生物量與耐受性。因此,豇豆作為模式植物用于構(gòu)建豆科植物——根瘤菌共生體系。(6)在PAHs新污染土壤與PAHs長期污染土壤生物修復(fù)機(jī)制的研究試驗(yàn)中,選用豇豆(Vigna unguiculata)作為研究載體,并且設(shè)置接種根瘤菌的處理,對比其在兩種不同類型土壤中的生長指標(biāo),研究根瘤外部形態(tài)和內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的差異。并且通過HPLC測定有無根瘤組織對于PAHs衰減的影響。通過DGGE分析共生體系四部分微域(非根際微域、根系表面微域、根瘤表面微域和根瘤內(nèi)部微域)對PHE的菌群響應(yīng)。通過研究表明:在新污染土壤中種植的豇豆根瘤外部形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)接近正常根瘤。而在長期污染土壤中種植的豇豆根瘤外部形態(tài)成黑褐色,顯微結(jié)構(gòu)與正常根瘤結(jié)構(gòu)具有明顯差異。通過HPLC的測定,發(fā)現(xiàn)保留正常根瘤組織的豇豆在PHE和PYR衰減試驗(yàn)中的降解率均高于去除根瘤組織的處理。通過平板升華法觀察到,根系表面微域和非根系土壤微域均有多環(huán)芳烴降解菌存在,在有多環(huán)芳烴的處理中,根瘤表面微域和根瘤內(nèi)部微域同樣出現(xiàn)多環(huán)芳烴降解菌。而在沒有添加多環(huán)芳烴的對照處理中,根瘤內(nèi)部和根瘤表面微域無多環(huán)芳烴降解菌。通過對豆科植物——根瘤菌共生體系四部分特殊微域的PHE降解菌進(jìn)行DGGE分析發(fā)現(xiàn),根系表面微域和非根際土壤微域相比與根瘤表面微域和根瘤內(nèi)部微域來說,具有更多樣化的PHE降解菌。根瘤內(nèi)部亦存在多環(huán)芳烴降解菌。除多環(huán)芳烴降解菌外,還存在其他菌種雖然對于多環(huán)芳烴沒有直接降解能力,但是能產(chǎn)生生物表面活性劑,或是根際促生菌。長期污染土壤比新污染土壤具有更高的降解菌群多樣性。(7)在多環(huán)芳烴PHE對三種表現(xiàn)型的豇豆種子的生態(tài)毒性效應(yīng)試驗(yàn)中,選擇三種不同表現(xiàn)型的豇豆品種(C1:有大量根系粘液層C2:有少量根系粘液層C3:無根系粘液層),研究不同濃度梯度的多環(huán)芳烴PHE(0 mg L-1,50 mg L-1,100 mg L-1,300 mg L-1,500 mg L-1)對三種豇豆種子的發(fā)芽與根伸長抑制生態(tài)毒性。結(jié)果表明,不同濃度多環(huán)芳烴PHE對于三種豇豆種子的發(fā)芽率均無影響,所有品種均100%萌發(fā)。但在15天培養(yǎng)期內(nèi),對三種豇豆類型種子的根伸長抑制率,莖伸長抑制率以及發(fā)芽指數(shù)有明顯差異�？傮w趨勢隨著PHE濃度的升高,影響程度越大。在低濃度的PHE存在下,對個(gè)別豇豆類型如C1的根、莖伸長具有促進(jìn)作用。不同濃度的多環(huán)芳烴PHE對于根伸長的影響大于對莖的影響。豇豆C1品種種子萌發(fā)過程對PHE表現(xiàn)出較大的耐受性,其原因可能與根部粘液層的分泌有關(guān),需進(jìn)一步研究。(8)在豇豆(Vigna unguiculata)根系粘液層對于生物修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤機(jī)制的研究中,采用三種相同生物型,不同表現(xiàn)型的豇豆品種(1)C1:有大量根系粘液層(2)C2:有少量根系粘液層(3)C3:無根系粘液層作為研究對象,分析豇豆產(chǎn)生的根系粘液層對于污染的土壤中PHE降解效果的影響。通過比較其在相同PHE濃度條件下的生長情況,測定各項(xiàng)生物指標(biāo)并運(yùn)用方差分析其顯著性。通過根系影印試驗(yàn)直觀觀察分析根系粘液物質(zhì)對于PHE降解的影響。運(yùn)用HPLC技術(shù)對土壤中PHE的降解率進(jìn)行測定,從而比較三種表現(xiàn)型豇豆品種對于PHE的修復(fù)效率。對根系粘液層物質(zhì)進(jìn)行放射性同位素14C標(biāo)記的14C-PHE礦化率試驗(yàn),從而直接分析根系粘液層物質(zhì)對與PHE礦化作用的影響。結(jié)果表明,豇豆C1在各項(xiàng)生物指標(biāo)中均表現(xiàn)出生長優(yōu)勢,尤其在結(jié)瘤量方面較其他處理顯著。說明豇豆C1在多環(huán)芳烴污染環(huán)境中能夠保持良好的生理功能,具有較高的抗逆性�？勺鳛槟Ｊ街参镉糜谏镄迯�(fù)土壤的多環(huán)芳烴污染。根系分泌的粘液物質(zhì)對于PHE降解圈的形成和擴(kuò)大起到了促進(jìn)作用。說明根系粘液物質(zhì)有助于根際微生物對于PHE的降解。接種了根瘤菌的豇豆C1處理(SHS+C1+R)對于PHE的降解效果最為顯著,降解率達(dá)到91.6%。而未種植豇豆的對照處理的降解率僅為48.4%和51.2%。豇豆C2、C3的處理無論是否接種根瘤菌對于PHE的降解差異不顯著。通過降解率試驗(yàn),豇豆C1類型比C2、C3類型對于土壤中PHE的降解率明顯提高,表明豇豆C1類型在生物修復(fù)的應(yīng)用上作為模式修復(fù)植物比C2、C3具有更加明顯的優(yōu)勢。在放射性同位素14C標(biāo)記的14C-PHE礦化率試驗(yàn)中,經(jīng)過20天的培養(yǎng)周期,添加了根系粘液物質(zhì)的土壤處理的礦化率比未添加根系粘液物質(zhì)的對照處理高12.0%。但是,純菌Delftia tsuruhatensis USACA0004-D17處理的礦化率曲線與土壤處理的礦化率曲線略有不同,呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)的趨勢。在第20天D17+RM測定的結(jié)果比D17處理的礦化率高8.8%。表明根系粘液層促進(jìn)了14C-PHE的礦化作用。(9)植物分泌的根系粘液層對于PAHs污染土壤中微生物種群的多樣性的影響迄今為止可以說是一個(gè)前人未涉及的領(lǐng)域,在生物修復(fù)研究中具有重要的意義。本試驗(yàn)采用磷酸脂肪酸分析法(PLFA)分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu),通過PCR-DGGE技術(shù)對比各處理根際土壤和非根際土壤的PAHs降解菌多樣性。并運(yùn)用主成分分析(PCA),神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析(ANN)等手段對數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理。DGGE結(jié)果表明:在生物修復(fù)過程中存在大量的不能直接降解PAHs的菌群,如根際促生菌、生物表面活性劑產(chǎn)生菌等,與PAHs降解菌共生,通過協(xié)同作用促進(jìn)難溶有機(jī)物PAHs的降解。根際土壤比非根際土壤的PHE降解菌多樣性程度更高,而且根瘤菌的加入促進(jìn)了根際PHE降解菌的多樣性,豇豆C1的根系粘液層的產(chǎn)生對于土壤中的PHE降解菌的生長具有積極作用。PLFA結(jié)果表明:豇豆C1根系粘液層的產(chǎn)生對土壤中微生物總量的變化不明顯,但是引起土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)的變化,豇豆C1與PLFA中的真菌生物量具有相關(guān)性。PHE的添加與GP/GN比率具有相關(guān)性。根瘤菌的添加對于土壤總菌群數(shù)量與結(jié)構(gòu)的影響不明顯。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X53;X17

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2755150