本文選題：秦川牛 + 肌肉發(fā)育　； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：牛的肌肉發(fā)育是一個十分復(fù)雜的過程，涉及大批基因的表達(dá)及網(wǎng)絡(luò)式的調(diào)控。目前，人們對牛肌肉發(fā)育的分子調(diào)控機理了解得并不清楚，因此，有必要進(jìn)一步的發(fā)掘與牛肌肉發(fā)育相關(guān)的基因，并對其功能和調(diào)控機理進(jìn)行研究。本研究以妊娠135天左右的胚胎和出生后30月齡的秦川牛背最長肌為研究對象，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）、同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）等篩選出了一大批在牛肌肉發(fā)育過程中差異表達(dá)的基因和差異表達(dá)的蛋白，并對差異基因和蛋白進(jìn)行了功能注釋和通路分析；運用實時定量PCR（qPCR）技術(shù)對篩選出的部分與肌肉發(fā)育相關(guān)的差異基因進(jìn)行了驗證，并分析其在牛肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)情況；此外，還將獲得的蛋白質(zhì)組結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.獲得了高質(zhì)量Clean Reads轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，與最新的牛參考基因組進(jìn)行比對，胎牛組和成年牛組比對上的Reads數(shù)分別為20255767條和20427874條，占牛的參考基因組的百分比例分別為79.11%和77.92%。 2.以錯誤發(fā)生率FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1作為判定差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出6800個差異表達(dá)的基因，其中以胎牛組Emb135d為對照，成年牛組30M背最長肌轉(zhuǎn)錄組中上調(diào)表達(dá)的基因有1893個，下調(diào)表達(dá)的基因有4907個。通過GO功能顯著性富集分析，差異基因分別被顯著富集到95個與生物學(xué)過程相關(guān)的條目，其中大部分條目涉及到生長發(fā)育過程；26個與分子功能相關(guān)的條目；71個與細(xì)胞組成相關(guān)的條目。KEGG通路分析表明，差異基因被顯著富集到了15條通路中。 3. qPCR檢測了47個差異基因在成年牛背最長肌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明實時定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，說明本實驗的分析結(jié)果基本可以反映牛背最長肌組織內(nèi)基因的真實表達(dá)情況。此外，還進(jìn)一步檢測了這47個差異基因在胎牛期Emb135d，新生牛期NB，成年牛期30M三個不同時期的肝、肺、脾、腎、心、胃、腸、肌肉（背最長肌）、脂肪（腹部脂肪）中的表達(dá)情況，定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)有25個基因在肌肉組織中呈現(xiàn)出特異性表達(dá)，有4個基因在脂肪組織中呈現(xiàn)出特異性表達(dá)。 4.通過比較潛在基因模型與現(xiàn)有基因注釋的差別，對基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，延長基因的5’端和3’端。結(jié)果顯示成年牛組30M中有2157個基因的5’端進(jìn)行延長，3531個基因的3’端進(jìn)行延長；胎牛組Emb135d中有2571個基因5’端進(jìn)行了延長，4625個基因3’端進(jìn)行了延長。此外，還檢測到了大量的新轉(zhuǎn)錄本，其中成年牛組30M中檢測到24464個新轉(zhuǎn)錄本，胎牛組Emb135d中檢測到29994個新轉(zhuǎn)錄本。同時，在秦川牛肌肉組織中，還發(fā)現(xiàn)了4種可變剪接模型，分別是外顯子跳躍、內(nèi)含子滯留、可變5’端剪切位點和可變3’端剪切位點模型，其中，可變3’端剪切模型是4種可變剪切模型中最常見數(shù)量最多的一種，約占40%的百分比例；內(nèi)含子滯留剪切模型是4種可變剪切模型中最稀有數(shù)量最少的一種。 5.通過比較新測序個體在基因組上的共有序列和參考序列，鑒定出單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。成年牛組30M中，共鑒定到31334個假定的SNPs；在胎牛組Emb135d中，共鑒定到30618個假定的SNPs。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，，牛29號染色體上存在著大量與生長和肉性狀相關(guān)的基因，因此，選取了位于牛29號染色體上的CSRP基因家族作為候選基因來驗證假定的SNPs。將CSRP基因家族擴增后的測序序列與參考序列進(jìn)行比對，共發(fā)現(xiàn)了8個SNPs，分別用不同的酶對這些位點進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果證實與測序結(jié)果相一致，說明本研究鑒定出的假定SNPs分析結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性較高。此外，在404頭秦川牛群體中，單個SNP位點不同基因型與生長和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，一些SNP位點與體高，體長，腰角寬，宰前活重，胴體重和屠宰率等性狀顯著（或極顯著）相關(guān)。 6.通過iTRAQ和LC-MS/MS技術(shù)，在成年牛組30M和胎牛組Emb135d中，共獲得了115380個二級譜圖；14250個譜圖能匹配到參考數(shù)據(jù)庫；11515個譜圖能匹配到特有肽段；鑒定到5327個肽段，其中5045個為特有肽段序列，共鑒定到1321個蛋白質(zhì)。 7.將鑒定到的所有蛋白進(jìn)行了相對分子質(zhì)量大小統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果顯示相對分子質(zhì)量大于100kDa的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，為280個；相對分子質(zhì)量小于10kDa的蛋白質(zhì)數(shù)量最少，僅檢測到3個，其余鑒定到的蛋白相對分子質(zhì)量范圍在10~100kDa之間。此外，還統(tǒng)計了不同長度肽段占所有肽段的百分比的分布情況，其中，含11個氨基酸殘基長度的肽段數(shù)量最多，約占所有肽段的12%；含22個以上和含7個以下氨基酸殘基長度的肽段數(shù)量最較少，約占到所有肽段的1%；大多數(shù)肽段長度范圍在9~20個氨基酸殘基之間，此類長度肽段約占所有肽段的50%。進(jìn)一步對鑒定到的蛋白所含肽段的數(shù)量分布情況進(jìn)行了統(tǒng)計，僅含1個肽段的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，而且還發(fā)現(xiàn)大部分被鑒定到的蛋白，其所含的肽段數(shù)量在10個以內(nèi)，且蛋白數(shù)量隨著匹配肽段數(shù)量的增加而減少。 8.胎牛組Emb135d為對照組，成年牛組30M為實驗組，兩組之間進(jìn)行比較，共篩選到了390個差異蛋白，其中上調(diào)表達(dá)的差異蛋白有67個，下調(diào)表達(dá)的差異蛋白有323個。進(jìn)一步對差異蛋白進(jìn)行了GO功能顯著性富集分析，差異蛋白被顯著富集到了102個與生物過程本體論相關(guān)的條目，其中大部分GO條目涉及到發(fā)育過程；12個與分子功能本體論相關(guān)的條目；21個與細(xì)胞組分本體論相關(guān)的條目。通過通路顯著性富集分析，確定了差異蛋白參與的7條最主要的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，分別涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工，卵母細(xì)胞的成熟分裂，朊蛋白類疾病，鏈霉素生物合成，神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路，檸檬酸循環(huán)，核糖體等。 9.將鑒定到的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)直系同源簇（clusters of orthologous groups, COG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對進(jìn)行COG注釋分析，結(jié)果顯示這些蛋白被歸類到24個COG簇中，主要的功能涉及通用功能預(yù)測，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊及伴侶蛋白，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)育，能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換等。 10.通過比較390個差異蛋白和對應(yīng)基因的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了4種不同類型的蛋白和基因表達(dá)量的變化表達(dá)模式，分別是蛋白下調(diào)-基因下調(diào)（264個），蛋白上調(diào)-基因上調(diào)（61個），蛋白下調(diào)-基因上調(diào)（59個），蛋白上調(diào)-基因下調(diào)（6個）；差異蛋白與基因的皮爾遜（person）相關(guān)性系數(shù)r為0.6061，呈顯著正相關(guān)。此外，對所有差異蛋白及其關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄本作了表達(dá)量關(guān)聯(lián)聚類分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異蛋白與其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式非常相似，極少數(shù)差異表達(dá)蛋白與其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式是相反的。 綜上所述，本研究獲得了高通量的牛背最長肌組織轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，更加全面的了解了牛背最長肌組織中基因和蛋白的表達(dá)情況，這些研究結(jié)果為闡明秦川牛肌肉發(fā)育的分子機制奠定了分子基礎(chǔ)。
[Abstract]:The muscle development of cattle is a very complex process involving the expression of a large number of genes and the regulation of network type . At present , it is not clear that the mechanism of molecular regulation of bovine muscle development is not clear . Therefore , it is necessary to further explore the genes related to bovine muscle development and to study its function and regulation mechanism .
Using real - time quantitative PCR ( qPCR ) technique , the difference gene related to muscle development was verified by qPCR , and its expression in bovine muscle development was analyzed .
In addition , the results of the obtained proteome are correlated with the results of transcriptome . The main research contents and results are as follows :

1 . The high quality Clean Reads transcriptome data was obtained , compared with the latest cattle reference genome , the number of Reads in the fetal bovine group and the adult cattle group was 20255767 and 204 27874 , respectively , and the percentages of the reference genome of the cattle were 79.11 % and 77.92 % , respectively .

2 . A total of 6800 differentially expressed genes were screened out with a false incidence rate of 0 . 001 and no log 2 Ratio 鈮

本文編號：1824613