本文關鍵詞：Non-coding RNAs調控DRG神經元參與神經再生的機制研究　出處：《蘇州大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：周圍神經損傷后，由于神經元內在再生能力的激活以及施萬細胞提供的再生微環(huán)境，周圍神經能夠實現(xiàn)成功再生，重新支配靶肌。L4-L6背根神經節(jié)（dorsal rootganglia，DRG）神經元是一種感覺神經元，其軸突分支組成了坐骨神經。在坐骨神經損傷后DRG神經元能維持存活和軸突再生，這個過程涉及眾多轉錄因子的激活和再生相關基因的轉錄調控。 非編碼RNA （non-coding RNA），包括microRNA （miRNA）為代表的小RNA和長鏈非編碼RNA（lncRNA, long non-coding RNA)，構成復雜的調控網絡，在表觀遺傳、轉錄及轉錄后等層面調控基因表達。miRNA是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA，由一段具有發(fā)夾結構的單鏈RNA前體經Drosha酶和Dicer酶剪切后生成。miRNA可以靶向目標mRNA分子3‘端非翻譯區(qū)（3‘-UTR），使mRNA分子降解或翻譯受到抑制，在轉錄后水平負調控許多基因的表達。研究表明miRNA參與細胞的凋亡、增殖、遷移、分化、發(fā)育和代謝等過程，在許多生理和病理過程中起到非常重要的作用。LncRNA指的是長度在200bp以上的RNA分子，由于它們不編碼蛋白，起初被認為是基因組轉錄的“噪音”。然而，近年來的研究表明，lncRNA參與了染色質修飾，轉錄激活和干擾，核內運輸?shù)榷喾N重要的調控過程。lncRNA的種類遠遠超過編碼RNA，但絕大多數(shù)功能不清楚。本文擬在坐骨神經損傷模型中，通過miRNA和lncRNA芯片，篩選出調控背根神經節(jié)神經元表型，激活其內在再生能力的非編碼RNA。 第一部分miR-21和miR-222靶向TIMP3抑制DRG神經元的凋亡 目的： 尋找調控DRG神經元凋亡的miRNA，并探討其作用機制。 方法： 1.采用Agilent miRNA和mRNA芯片，對大鼠坐骨神經損傷后0d，1d，4d和7d的L4-L6DRG中miRNA和mRNA的表達譜進行了系統(tǒng)性分析。 2.運用生物信息分析軟件預測差異表達miRNA的靶基因（TargetScan、miRanda）及其功能富集情況（GO）。 3.對芯片結果進行qRT-PCR驗證。 4.結合芯片驗證情況和生物信息學分析選取部分miRNA在體外培養(yǎng)的背根神經節(jié)神經元中進行功能學研究。通過流式凋亡檢測分析了神經元中過表達miR-21和miR-222模擬物對背根神經節(jié)神經元凋亡的影響。 5.通過CCK-8細胞活力檢測分析過表達miR-21和miR-222模擬物對背根神經節(jié)神經元細胞活力的影響。 6. Western blot檢測分析過表達miR-21和miR-222模擬物對背根神經節(jié)神經元細胞Caspase-3活化的影響。 7.結合芯片驗證情況和生物信息學分析，確定TIMP3可能是miR-21和miR-222的靶基因。 8.體外培養(yǎng)的神經元中過表達miR-21和miR-222模擬物，qRT-PCR和Western blot檢測TIMP3mRNA和蛋白表達水平。 9.檢測調控miR-21表達的上游信號通路。在培養(yǎng)的DRG神經元中加入IL-6，收集細胞RNA，qRT-PCR檢測miR-222及TIMP3的表達情況。 結果： 1.系統(tǒng)性分析了L4-L6背根神經節(jié)在損傷后4個不同時間點miRNA表達譜的變化，一共找到13個差異表達的miRNA。 2.構建13個差異表達的miRNA和45個靶基因的網絡圖。 3. qRT-PCR證實miR-21和miR-222的表達變化和芯片結果一致。 4.流式凋亡檢測發(fā)現(xiàn)過表達miR-21和miR-222抑制背根神經節(jié)神經元的凋亡。 5. CCK-8細胞活力分析發(fā)現(xiàn)過表達miR-21和miR-222可以增加背根神經節(jié)神經元的存活。 6. Western blot結果顯示過表達miR-21和miR-222可以抑制Caspase-3的活化。 7. qRT-PCR和Western blot結果顯示，體外培養(yǎng)的神經元中過表達miR-21和miR-222抑制TIMP3mRNA和蛋白的表達。 8. qRT-PCR結果顯示IL-6激活可以上調背根神經節(jié)神經元中miR-21的表達，進而下調TIMP3mRNA的表達。 結論： 通過系統(tǒng)性分析坐骨神經損傷后L4-L6背根神經節(jié)miRNA的表達譜變化，結合生物信息學分析和功能篩選發(fā)現(xiàn)了miR-21和miR-222通過靶向TIMP3抑制背根神經節(jié)神經元的凋亡。另外，IL-6刺激背根神經節(jié)神經元可以上調miR-21的表達。這有助我們從新的角度解釋周圍神經損傷和修復的機制，為將來的臨床治療提供新的思路。 第二部分miR-222靶向PTEN促進DRG神經元突起的生長 目的： 尋找調控DRG神經元突起生長的miRNA，并探討其作用機制。 方法： 1.采用Agilent miRNA和mRNA芯片，對大鼠坐骨神經損傷后0d，1d，4d，7d和14d的L4-L6DRG中miRNA和mRNA的表達譜進行了系統(tǒng)性分析。 2.運用生物信息分析軟件預測差異表達miRNA的靶基因（TargetScan、miRanda）及其功能富集情況（GO）。 3.對芯片結果進行qRT-PCR和原位雜交驗證。 4.結合芯片驗證情況和生物信息學分析選取部分miRNA在體外培養(yǎng)的背根神經節(jié)神經元中進行功能學研究。通過測量神經元突起長度分析了在神經元中表達miR-222模擬物和抑制劑對背根神經節(jié)神經元突起生長的影響。 5.結合芯片驗證情況和生物信息學分析，確定PTEN可能是miR-222的靶基因。 6.體外神經元中表達miR-222模擬物和抑制劑，qRT-PCR和Western blot檢測PTEN mRNA和蛋白表達水平。 7.設計siRNA干擾PTEN表達，檢測PTEN對DRG神經元突起生長的作用，共轉PTEN siRNA和miR-222抑制劑，確定PTEN是否為miR-222的功能性靶基因。 8.檢測miR-222調控的靶基因及其下游信號通路。Co-IP實驗尋找DRG神經元中與PTEN共同起作用的基因。 9.檢測調控miR-222表達的上游信號通路。在培養(yǎng)的DRG神經元中加入c-Jun激活劑anisomycin，收集細胞RNA或蛋白，qRT-PCR或Western blot檢測miR-222及PTEN的表達情況。 10.檢測調控DRG神經突起生長的不同信號通路之間的協(xié)調作用。在培養(yǎng)的DRG神經元過表達miR-222或PTEN siRNA，12h后加入cAMP激活劑Db-cAMP，分析突起的生長情況。 結果： 1.系統(tǒng)性分析了L4-L6背根神經節(jié)在損傷后5個不同時間點miRNA表達譜的變化，一共找到26個差異表達的miRNA。 2.生物信息學分析表明26個差異表達miRNA的638個潛在靶基因參與了神經再生的眾多生物學過程。 3. qRT-PCR和原位雜交證實miR-222的表達變化和芯片結果一致。 4.突起生長實驗發(fā)現(xiàn)miR-222通過靶向PTEN促進背根神經節(jié)神經元突起的生長。 5. Western blot結果顯示過表達miR-222可以促進CREB磷酸化，Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)PTEN能與CREB發(fā)生相互作用。 6. qRT-PCR結果顯示c-Jun激活可以上調miR-222的表達。Western blot結果顯示c-Jun激活可以下調PTEN表達，促進CREB磷酸化。 7.通過miR-222或siRNA干擾PTEN，發(fā)現(xiàn)cAMP信號通路協(xié)同促進DRG神經元突起的生長。 結論： 通過系統(tǒng)性分析坐骨神經損傷后L4-L6背根神經節(jié)miRNA的表達譜變化，結合生物信息學分析和功能篩選發(fā)現(xiàn)了miR-222通過靶向PTEN促進背根神經節(jié)神經元突起的生長。另外，c-Jun激活上調miR-222的表達，miR-222也可以通過PTEN調節(jié)CREB磷酸化。這有助我們從新的角度解釋周圍神經損傷和修復的機制，為將來的臨床治療提供新的思路。 第三部分LncRNABC089918抑制DRG神經元突起的生長 目的： 尋找調控DRG神經元突起生長的lncRNA，，并探討其作用機制。 方法： 1.采用Arraystar4×44K Rat LncRNA芯片，對大鼠坐骨神經損傷后0d，1d，4d和7d的L4-L6DRG中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜進行了系統(tǒng)性分析。 2.運用生物信息分析預測差異表達lncRNA相關的基因（共表達網絡）及其功能富集情況（GO和KEGG）。 3.對芯片結果進行qRT-PCR和原位雜交驗證。 4.結合芯片驗證情況和生物信息學分析選取部分lncRNA在體外培養(yǎng)的背根神經節(jié)神經元中進行功能學研究。通過測量神經元突起長度分析了在神經元中siRNA干擾lncRNA BC089918對背根神經節(jié)神經元突起生長的影響。 結果： 1.系統(tǒng)性分析了L4-L6背根神經節(jié)在損傷后4個不同時間點lncRNA表達譜的變化，一共找到105個差異表達的lncRNAs。 2.生物信息學分析表明與24個下調的差異表達lncRNAs共表達的115個相關基因參與了神經再生的眾多生物學過程。 3. qRT-PCR和原位雜交證實lncRNA BC089918的表達變化和芯片結果一致。 4.突起生長實驗發(fā)現(xiàn)siRNA干擾lncRNA BC089918的表達能促進背根神經節(jié)神經元突起的生長。 結論： 通過系統(tǒng)性分析坐骨神經損傷后L4-L6背根神經節(jié)lncRNA的表達譜變化，結合生物信息學分析和功能篩選發(fā)現(xiàn)了lncRNA BC089918抑制背根神經節(jié)神經元突起的生長。這有助我們從一全新的角度解釋周圍神經損傷和修復的機制，為將來的臨床治療提供一個新的思路。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R339.37

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前4條

1 Lindsey E.Becker Buscaglia;;Apoptosis and the target genes of microRNA-21[J];癌癥;2011年06期

2 Anjie Lu;Zufa Huang;Chaoyue Zhang;Xianfang Zhang;Jiuhong Zhao;Haiying Zhang;Quanpeng Zhang;Song Wu;Xinan Yi;;Differential expression of microRNAs in dorsal root ganglia after sciatic nerve injury[J];Neural Regeneration Research;2014年10期

3 Dengbing Yao;Meiyuan Li;Dingding Shen;Fei Ding;Shibi Lu;Qing Zhao;Xiaosong Gu;;Expression changes and bioinformatic analysis of Wallerian degeneration after sciatic nerve injury in rat[J];Neuroscience Bulletin;2013年03期

4 Saijilafu;Bo-Yin Zhang;Feng-Quan Zhou;;Signaling pathways that regulate axon regeneration[J];Neuroscience Bulletin;2013年04期

本文編號：1313116