本文關(guān)鍵詞：非綜合征性腭裂患者差異miRNA與靶基因分析及人心肌實時RT-PCR內(nèi)參標志物在死亡早期穩(wěn)定性的評估

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【摘要】：上篇 研究背景 唇腭裂(Cleft lip with or without cleft palate, CL/P)是一種常見的出生缺陷,包括先天性唇裂(cleft lip, CL)和先天性腭裂(cleft palate, CP).根據(jù)是否伴發(fā)其它出生缺陷,CL/P又可分為綜合征性唇腭裂(syndromic cleft lip and/or palates,SCL/P)和非綜合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft Lip and/or palates, NSCL/P)。其中,80%-85%的CP屬于非綜合征性腭裂(nonsyndromic cleft palate, NSCP),臨床表型相對單一。唇腭裂在全世界的發(fā)病率為1/500-1/1000。我國為唇腭裂的高發(fā)國家,發(fā)病率為0.182%,近幾年的數(shù)據(jù)顯示我國唇腭裂的發(fā)病數(shù)呈居高不下的趨勢,居我國出生缺陷前五位。唇腭裂給患者造成包括外貌、吞咽、語音以及心理等方面諸多不利的影響,也給家庭和社會帶來經(jīng)濟負擔。目前的研究認為,CL/P是由環(huán)境因素和遺傳學(xué)因素相互作用引起的復(fù)雜性遺傳病。但是,CL/P的具體發(fā)病機制尚不清楚。 每10000個新生兒中約有1.3-25.3個會出現(xiàn)NSCP的表型。NSCP亦是受遺傳與環(huán)境多因子影響的疾病。已有研究發(fā)現(xiàn)NSCP的候選基因,如WANG等發(fā)現(xiàn)了ROR2基因上的3個SNPs(rs7858435,rs10820914和rs3905385)與亞洲人NSCP的發(fā)生有顯著的相關(guān)性；Sairee等在人類NSCP病人中發(fā)現(xiàn)了PDGFRa的突變；FitzPztrick等在NSCP病人的2q32-q33異位突變區(qū)確定了候選基因SATB2。然而,陽性家族史所占的比例較少,國外報道的CL/P陽性家族史比例為20%以上,而國內(nèi)比例低于國外,一般為5%-10%。多數(shù)病例并不能用遺傳學(xué)來解釋,因此眾多學(xué)者研究了遺傳學(xué)因素以外的相關(guān)因素如環(huán)境因素、生活質(zhì)量等對腭發(fā)育的影響,其中表觀遺傳學(xué)對腭發(fā)育的影響成為了研究的熱點。Abbott等發(fā)現(xiàn)激素類藥物如潑尼松、地塞米松等能引起腭突發(fā)育過程中表皮生長因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)及其受體分布的改變,引起腭裂的發(fā)生。石冰等的研究結(jié)果也顯示地塞米松可以誘導(dǎo)小鼠形成腭裂,同時采用維生素B6、維生素B12可預(yù)防腭裂畸形的發(fā)生。在1niRNAf方面,研究顯示miR-140通過調(diào)控Pdgfra信號通路在斑馬魚腭的發(fā)育中發(fā)揮作用；Shin等用原位雜交的方法檢測到了小鼠腭間充質(zhì)中miR-200b、 Smad2和Snail的表達,但當腭弓融合后,圍繞在融合部位的間充質(zhì)區(qū)域不在有miR-200b的表達。體外實驗發(fā)現(xiàn),異位表達的miR-200b導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化生長因子-β(Tgf-β)信號通路調(diào)節(jié)因子Smad2(?)(?)Snail表達的抑制,以及腭突融合區(qū)域細胞凋亡與增殖的改變。結(jié)果顯示miR-200b通過調(diào)控Tgf-β信號通路中的關(guān)鍵因子Smad2和Snail而影響腭的發(fā)育,特別是腭突的融合。這些研究都從表觀遺傳學(xué)的角度揭示了腭的發(fā)育分化機制,但研究都是基于動物實驗,至今并未見基于人類的、研究NSCP患者差異miRNA及其發(fā)病機制的相關(guān)報道。 表觀遺傳學(xué)主要涉及非編碼RNA、DNA甲基化、基因組印記、隨機染色體(X)失活、染色體重塑以及組蛋白修飾改變等。在遺傳與環(huán)境共同影響發(fā)病的疾病研究中,表觀遺傳學(xué)已受到眾多學(xué)者的關(guān)注。其中,miRNA已經(jīng)成為了研究熱點。miRNA是一類長約22-25nt的非編碼功能小、RNA。成熟的miRNA通過與靶基因3’非翻譯區(qū)(3'-UTR區(qū))形成不完全配對,從而抑制靶基因翻譯,或形成接近完全的配對,導(dǎo)致靶mRNA降解。miRNA在很多生物的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用,影響細胞發(fā)育、增殖、凋亡,在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要的作用,如已有研究發(fā)現(xiàn)niRNA(?)工蛋白編碼基因Dicer在小鼠心臟的特異性敲除會導(dǎo)致胎鼠心臟的嚴重畸形。小鼠心肌特異表達基因miR-1的敲除會導(dǎo)致50%的小鼠因心室隔膜形成異常而造成死胎,15%的小鼠在出生后2-3月會因嚴重的心臟缺陷而死亡。對niRNA的研究將有助于揭示胚胎畸形的發(fā)病機制。 遺傳與環(huán)境因素共同影響CL/P的發(fā)生,雖然一些基因突變可導(dǎo)致CL/P的發(fā)生,但遺傳學(xué)因素以外的例如環(huán)境因素等作為獨立的發(fā)病因素,異或通過環(huán)境-基因相互作用的方式也能導(dǎo)致CL/P的發(fā)生。因此,表觀遺傳學(xué)的改變在CL/P的發(fā)生過程中的作用逐漸受到重視。然而,目前尚未見關(guān)于人類CL/P差異miRNA的研究。為此,我們選取臨床表型相對單一的NSCP病人作為研究對象,探討與人類NSCP相關(guān)的差異miRNA及其靶基因,以期從表觀遺傳學(xué)的角度揭示NSCP可能的發(fā)病機制,為人類CL/P預(yù)防干預(yù)的政策制定提供直接的依據(jù)。 研究目的 尋找非綜合征性腭裂相關(guān)的miRNA及其靶基因。 方法和結(jié)果 (1)本實驗從河北市邯鄲中心醫(yī)院與云南省微笑列車行動中收集到50例被診斷為NSCP的患者矯形手術(shù)后的軟腭組織樣本,從復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系收集到20例正常對照的軟腭組織樣本,均來自道路交通事故案例。收集到的樣本立即放入RNA Later保護液(Ambion, USA)中,于-80℃保存。所有的樣本收集均受倫理委員會批準。 (2)采用TRIzol法抽提樣本RNA,經(jīng)檢測(?)RNA質(zhì)量合格后,應(yīng)用佰真公司Agilent GeneChip miRNA Array芯片對6例正常對照樣本和10例非綜合征性腭裂患者軟腭組織樣本進行差異miRNA初步篩選。根據(jù)軟件運算和人工比對,我們共選定了12個候選miRNA進行下一步的驗證工作。 (3)我們在20例正常對照樣本和50例非綜合征性腭裂患者軟腭組織中用實時定量PCR方法驗證芯片篩選結(jié)果,結(jié)果經(jīng)Mann-Whitney U檢驗統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)4個miRNA (miR-1246、miR-1323、miR-93和miR-143*)在對照組和病例組中存在表達差異,p0.05。 (4)為了檢驗4個(?)niRNA是否是非綜合征性腭裂患者的危險因素,我們采用風(fēng)險性分析計算了OR值(odds ratio),統(tǒng)計結(jié)果分別為：miR-1246(OR=13.67,95%CI:2.480-75.30), miR-1323(OR=12.0,95%CI:1.791-80.42)、miR-93(OR=9.75,95%CI:1.642-57.89)、miR-143*(OR=5.25,95%CI：1.021-27.00)。結(jié)果顯示(?)niR-1246、miR-1323和]niR-93的表達上調(diào),miR-143*的表達下調(diào)是非綜合征性腭裂發(fā)生的高危因素。 (5)因為miRNA的表達具有時空特異性,在發(fā)育的不同階段存在表達差異。并且由于收集到年齡相匹配的樣本存在一定的困難,我們的實驗樣本存在年齡的差異。為了排除年齡差異對檢測結(jié)果造成的影響,我們分析了4個miRNA的表達與年齡之間的相關(guān)性,經(jīng)過對Pearson's(?)目關(guān)系數(shù)的統(tǒng)計,我們發(fā)現(xiàn)檢測到的4個miRNA的表達與年齡無關(guān),排除了年齡因素對驗證結(jié)果的影響。 (6)研究發(fā)現(xiàn)非綜合征性腭裂患者男性多于女性,因此我們分析了檢測到的4個miRNA與性別之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個miRNA的表達在男性與女性之間無統(tǒng)計學(xué)差異,不受性別因素的影響；但是我們發(fā)現(xiàn)在NSCP組4個miRNA的表達水平與男性有顯著的相關(guān)性,這一發(fā)現(xiàn)支持流行病學(xué)研究結(jié)論：非綜合征性腭裂更多發(fā)于男性。 (7)為了尋找1miRNA對非綜合征性腭裂可能的發(fā)病機制,我們通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測了4個差異表達：miRNA可能的靶基因,并通過實時定量PCR的方法對靶基因進行了驗證。最終我們確定了2個靶基因,分別是FGFR2與WNT5A。其中,FGFR2S是miR-1246、miR-1323、miR-93的靶基因,表達下調(diào)；WNT5A是miR-143*的靶基因,表達上調(diào)。 總結(jié)與展望 我們采用高通量miRNA Array芯片的方法,在非綜合征性腭裂患者中發(fā)現(xiàn)了4個差異表達的miRNA。其中,1miR-1246、miR-1323和1miR-93表達上調(diào),miR-143*的表達下調(diào)。并且通過預(yù)測與驗證發(fā)現(xiàn)FGFR2是miR-1246、miR-1323和miR-93的靶基因,與正常對照組相比在NSCP病例組中表達下調(diào)；WNT5A是miR-143*的靶基因,與正常對照組相比在NSCP病例組中表達上調(diào)。 雖然,本實驗從表觀遺傳學(xué)的角度發(fā)現(xiàn)了與NSCP相關(guān)的(?)(?)iRNA及其靶基因,但是,miRNA對靶基因的調(diào)控效率以及靶基因所在信號通路在腭的發(fā)育中發(fā)揮的調(diào)控作用這些都是亟待進一步研究的內(nèi)容。進一步的研究將在模式生物的基礎(chǔ)上、從信號分子調(diào)控的角度深入揭示NSCP的發(fā)病機制。發(fā)病機制的闡明將為先天性腭裂的早期預(yù)防及妊娠期的干預(yù)治療提供新的思路。 下篇 研究背景 死亡時間(postmortem interval, PMI)推斷是法醫(yī)學(xué)最重要的任務(wù)之一,準確的PMI推斷,有利于迅速確定涉案罪犯以及排除嫌疑人。傳統(tǒng)的PMI推斷方法主要根據(jù)尸體現(xiàn)象(如尸斑、尸冷、尸僵、角膜混濁等)、胃內(nèi)容物的消化程度、蠅蛆的生長規(guī)律以及植物根系和苔蘚類生物的生長變化等。但這些方法都容易受到外界環(huán)境的干擾。分子生物學(xué)的飛速發(fā)展為這一課題提供了新思路,其中尸體樣本中的核酸分析技術(shù)的應(yīng)用,特別是通過實時RT-PCR的方法研究核酸降解規(guī)律與PMI之間的關(guān)系已成為研究者的焦點。由于實時RT-PCR方法得到的結(jié)果必須依賴于準確的內(nèi)參基因的標準化,才能排除個體之間的差異,因此尋找穩(wěn)定的用于PMI研究的內(nèi)參基因就顯得十分必要。 本實驗選擇β-actin、GAPDH、B2M、U6、18SrRNA和hsa-mir-1共6個常用的內(nèi)參分子標志物。通過實時定量PCR技術(shù)對早期死亡時間心肌組織中各內(nèi)參分子標志物的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測,分析內(nèi)參分子標志物在早期死亡時間內(nèi)的穩(wěn)定性。旨在為心肌組織中早期死亡時間推斷的實時定量PCR研究提供準確穩(wěn)定的內(nèi)參分子標志物。 研究目的 尋找用于早期死亡時間人心肌內(nèi)實時定量PCR穩(wěn)定的內(nèi)參分子標志物。 方法和結(jié)果 (1)與上海市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所合作,收集10例具有不同死亡時間的案例樣本,尸體的外界環(huán)境相似(尸體解剖均在室內(nèi)存放,平均室溫25℃)且尸體并沒有呈現(xiàn)肉眼可見的腐敗現(xiàn)象。每例尸體都準確的記錄死亡時間(4.3h-22.3h)、死因等。取左心室肌肉組織50-100mg,分裝于RNAlater保護液(Ambion公司,美國),立即置于-80℃凍存、備用。以上樣本收集均受倫理委員會批準。 (2)選取6個常用的管家基因及與心臟發(fā)育相關(guān)的miRNA作為待評估的內(nèi)參分子標準物,并設(shè)計引物,分別是β-actin、GAPDH、B2M、U6、18SrRNA和hsa-mir-1。 (3)采用TRIzol法抽提樣本總RNA、cDNA合成,應(yīng)用實時定量PCR檢測6個分子標志物在不同的死亡時間的表達量。 (4)通過genormPLUS程序?qū)?個選取的內(nèi)參分子標志物在不同死亡時間的表達量進行統(tǒng)計處理,計算其表達穩(wěn)定度平均值M。結(jié)果顯示U6的表達穩(wěn)定度平均值M最小,表達最穩(wěn)定。 (5)為了進一步檢驗U6表達的穩(wěn)定性,我們分析了性別、年齡與死因與U6表達的相關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果顯示U6的表達在男性與女性之間無統(tǒng)計學(xué)差異,同時U6的表達與年齡、死因無相關(guān)性。揭示在早期死亡時間U6的表達量不受性別、年齡與死因的影響,是理想的用于早期死亡時間人心肌研究的實時定量PCR內(nèi)參標志物。 結(jié)論與展望 在人心肌內(nèi)U6的表達在早期死亡時間內(nèi)最穩(wěn)定,并且不受年齡、性別與死因的影響,是一個理想的使用實時定量PCR的方法研究死亡時間推斷的內(nèi)參標志物。 進一步的研究將在擴大樣本的基礎(chǔ)上,在其他常用檢材組織,比如皮膚、骨骼肌、腦、脾等進行研究,尋找每個組織最適合的內(nèi)參,以期運用最穩(wěn)定的內(nèi)參、采用實時定量PCR的方法研究死亡時間與核酸降解之間的規(guī)律,并且建立多指標降解規(guī)律與死亡時間之間的數(shù)學(xué)模型。這將會使死亡時間推斷更加精確,更有利于法醫(yī)實際工作的開展。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R782.21

【參考文獻】

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本文編號：1161205