本文關(guān)鍵詞：苧麻谷氨酰胺合成酶基因的克隆和超量表達(dá)研究

  更多相關(guān)文章： 苧麻 GS基因克隆 表達(dá)模式 轉(zhuǎn)基因 超量表達(dá) 氮代謝

【摘要】：氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，直接影響著植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，決定著作物產(chǎn)量的高低和品質(zhì)的優(yōu)劣。谷氨酰胺合成酶（GS）作為高等植物氮代謝途徑中氮素初始同化中的關(guān)鍵酶，是一切無(wú)機(jī)氮素進(jìn)入高等植物體內(nèi)的“門戶”，影響著植物氮素營(yíng)養(yǎng)的吸收、同化及利用效率，對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，及產(chǎn)量、品質(zhì)等農(nóng)藝性狀具有決定性作用。高等植物中谷氨酰胺合成酶分為胞液型（GS1）和質(zhì)體型（GS2）兩類：GS2主要同化NO-3還原而來(lái)及光呼吸過(guò)程所釋放的氨；GS1主要同化從土壤吸收的和由NO-3還原而來(lái)的氨，及再同化從植物體內(nèi)各個(gè)氮循環(huán)途徑所釋放的氨。苧麻（Boehmeria nivea L.）作為古老的纖維作物，近年來(lái)因其葉片中蛋白質(zhì)及必須氨基酸含量較高、嫩莖葉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與苜蓿相近、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)合理、年生物產(chǎn)量大等，被作為植物蛋白飼料原料而大量利用；同時(shí)，苧麻具有植株生長(zhǎng)速度快、對(duì)氮素需求量大等特點(diǎn)。但是，國(guó)內(nèi)外與苧麻氮代謝及生長(zhǎng)特性相關(guān)的研究幾乎為零，也沒有進(jìn)行苧麻氮代謝途徑中功能基因的發(fā)掘，相關(guān)功能的研究和利用，從而阻礙了研究者對(duì)苧麻飼用及生長(zhǎng)特性在本質(zhì)上的了解，同時(shí)，也不利于苧麻中優(yōu)良功能基因的發(fā)掘和利用。因此，本文以植物氮代謝途徑中關(guān)鍵基因GS為研究對(duì)象，首次從苧麻中克隆獲得GS基因家族中的4個(gè)基因，并利用生物信息學(xué)對(duì)苧麻BnGS基因序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了苧麻GS基因在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)模式，同時(shí)，利用ClustalW和MEGA軟件對(duì)GS基因進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析；另一方面，本文利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建了苧麻BnGS1-2基因的超量植物表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，同時(shí)，研究了超量表達(dá)苧麻BnGS1-2基因后，轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)氮素的同化和利用效率，為了解苧麻GS基因的功能，及利用苧麻BnGS基因改良植物氮素利用效率和農(nóng)藝性狀的研究提供新的基因資源。本文主要研究結(jié)果如下： （1）首次從苧麻栽培品種“中苧1號(hào)”中克隆獲得苧麻GS基因家族中的4個(gè)基因，其中兩個(gè)屬于胞液型GS，命名為BnGS1-1和BnGS1-2；另外兩個(gè)為質(zhì)體型GS基因，命名為BnGS2-1和BnGS2-2，同時(shí)選取9株“中苧1號(hào)”自交后代，利用內(nèi)切酶TaqⅠ酶切位點(diǎn)對(duì)兩個(gè)質(zhì)體型BnGS2基因進(jìn)行TaqⅠ酶酶切鑒定，結(jié)果表明BnGS2-1和BnGS2-2為一對(duì)等位基因。 （2）利用生物信息學(xué)對(duì)苧麻GS基因序列和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明BnGS1-1基因序列全長(zhǎng)1205bp，含一個(gè)1071bp的開放閱讀框（ORF），編碼356個(gè)氨基酸殘基多肽；BnGS1-2基因序列全長(zhǎng)1222bp，起始密碼子位于第123-125bp，終止密碼子位于1102-1104bp，編碼356個(gè)氨基酸殘基多肽；兩個(gè)BnGS2等位基因序列全長(zhǎng)1340bp，含一個(gè)1293bp的ORF區(qū)，編碼430個(gè)氨基酸殘基多肽；通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)BnGS2等位基因ORF區(qū)11個(gè)位點(diǎn)核苷酸存在差異，導(dǎo)致編碼的多肽在195、382兩個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸存在替換現(xiàn)象；苧麻BnGS基因家族編碼的多肽序列含有beta-Grasp和catalytic兩個(gè)保守功能域，均屬于Gln-synt結(jié)構(gòu)域，同時(shí)，BnGS2基因編碼的多肽序列含有一段信號(hào)肽；所克隆的苧麻BnGS基因家族編碼的多肽序列在56、92、249和297位點(diǎn)上的氨基酸殘基分別為天冬氨酸、半胱氨酸、組氨酸和谷氨酸，苧麻BnGS2等位基因在306和371兩個(gè)位點(diǎn)上都為半胱氨酸殘基。 （3）利用EMBOSS和MEGA軟件對(duì)苧麻BnGS基因家族進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)苧麻BnGS基因在蛋白質(zhì)序列上的相似性為77.25-91.57%，在核苷酸序列上的相似性為71.15-79.37%，并且BnGS1兩個(gè)基因之內(nèi)要比BnGS1與BnGS2之間的相似性高。通過(guò)對(duì)苧麻和其它物種GS基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，BnGS1-2基因在進(jìn)化上起源于雙子葉植物，而BnGS1-1基因卻被聚類在單子葉植物分支上，同時(shí)，苧麻BnGS1-2和BnGS2與苜蓿（Medicago sativa），大豆（Glycine max）和豌豆（Phaseolus vulgaris）等具有較近的親緣關(guān)系。 （4）利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析苧麻BnGS基因在不同部位和發(fā)育階段的表達(dá)模式，結(jié)果表明BnGS1-1、BnGS1-2和BnGS2在苧麻葉片、莖、根、韌皮部及木質(zhì)部中都有表達(dá)，但在不同的部位不同的BnGS基因的表達(dá)水平卻呈現(xiàn)明顯的差異。BnGS2基因主要的表達(dá)部位為葉片，同時(shí)，隨著發(fā)育階段的不同，相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)明顯的不一樣，表達(dá)量最高的時(shí)期為出苗期和纖維發(fā)育期；BnGS1-1基因在葉子、根和韌皮部中的相對(duì)表達(dá)量明顯比莖及木質(zhì)部高，但是在成熟階段葉片中BnGS1-1的mRNA水平呈顯著下降；韌皮部、木質(zhì)部和莖中的BnGS1-2基因，在纖維發(fā)育時(shí)期被大量的誘導(dǎo)，表明苧麻BnGS1-2基因可能在纖維的發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。另一方面，BnGS1-1和BnGS1-2基因在苧麻整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，在根部的表達(dá)量都呈現(xiàn)較高的水平。因此，苧麻不同的BnGS基因通過(guò)在特定部位表達(dá)量水平的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控苧麻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的需要。 （5）本文利用同源重組技術(shù)將苧麻BnGS1-2基因轉(zhuǎn)入pBI121植物表達(dá)載體特定位點(diǎn)，構(gòu)建了能超量表達(dá)BnGS1-2基因的植物表達(dá)載體。在農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404的介導(dǎo)下，通過(guò)葉盤法將構(gòu)建的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中。通過(guò)Kana篩選和基因組DNA PCR驗(yàn)證，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。利用Q-PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T1進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BnGS1-2在轉(zhuǎn)基因植株中檢測(cè)到表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草中GS酶活性是野生型的1-2倍。超量表達(dá)BnGS1-2基因能顯著增加轉(zhuǎn)基因煙草植株的株高、鮮重和葉面積，因此，超量表達(dá)BnGS1-2基因能促進(jìn)煙草植株的生長(zhǎng)；另一方面，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)水溶性蛋白與野生型煙草相比呈現(xiàn)極顯著性升高，增長(zhǎng)率達(dá)92.02%，總氮含量有所提高，但并沒有達(dá)到顯著性水平，，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)游離NH+4含量顯著下降，而游離NO-3含量與野生型相一致，因此，超量表達(dá)BnGS1-2基因，能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)氮素的吸收和利用，提高氮代謝效率，從而能夠保證植株快速生長(zhǎng)對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的需求。總之，本研究為苧麻GS基因功能的研究和應(yīng)用提供一個(gè)理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：苧麻 GS基因克隆 表達(dá)模式 轉(zhuǎn)基因 超量表達(dá) 氮代謝
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：S563.1
【目錄】：

• 博士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)簽名表3-6
• 摘要6-8
• Abstract8-17
• 附圖索引17-18
• 附表索引18-19
• 英文縮略表19-20
• 第一章 緒論20-32
• 1.1 植物體內(nèi)氮的營(yíng)養(yǎng)特征20-22
• 1.1.1 氮的生物學(xué)功能20
• 1.1.2 植物對(duì)氮的吸收和利用20-22
• 1.2 植物谷氨酰胺合成酶研究現(xiàn)狀22-24
• 1.2.1 谷氨酰胺合成酶的類型22
• 1.2.2 谷氨酰胺合成酶的功能22-24
• 1.3 植物對(duì)氮素的利用效率24-27
• 1.3.1 硝酸的還原24-25
• 1.3.2 氨的同化25-26
• 1.3.3 氨基基團(tuán)的相互轉(zhuǎn)化26-27
• 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)27-29
• 1.4.1 基本原理和過(guò)程27
• 1.4.2 主要類型27-28
• 1.4.3 熒光定量的方法28
• 1.4.4 內(nèi)參基因的選擇28-29
• 1.5 苧麻概論29-30
• 1.5.1 苧麻基本概論29
• 1.5.2 苧麻飼用特性29-30
• 1.5.3 苧麻生長(zhǎng)特點(diǎn)30
• 1.5.4 苧麻育種目標(biāo)30
• 1.6 研究目的和意義30-32
• 第二章 苧麻谷氨酰胺合成酶（GS）基因家族的克隆、序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析32-47
• 2.1 材料和方法32-37
• 2.1.1 試驗(yàn)材料32
• 2.1.2 儀器和試劑32
• 2.1.3 RNA 提取和 cDNA 合成32-33
• 2.1.4 GS 基因家族 PCR 擴(kuò)增33-34
• 2.1.5 目的片段回收34-35
• 2.1.6 目的片段與載體連接35
• 2.1.7 目的片段轉(zhuǎn)化35
• 2.1.8 目的片段序列測(cè)定35-36
• 2.1.9 BnGS2 等位基因的鑒定36
• 2.1.10 BnGS 基因家族序列分析36
• 2.1.11 BnGS 基因家族進(jìn)化分析36-37
• 2.2 試驗(yàn)結(jié)果37-45
• 2.2.1 苧麻 RNA 的提取37
• 2.2.2 苧麻 GS 基因家族克隆37-38
• 2.2.3 BnGS2 等位基因鑒定38-39
• 2.2.4 BnGS2 等位基因序列比對(duì)39-40
• 2.2.5 BnGS 基因家族序列分析40-43
• 2.2.6 BnGS 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析43-45
• 2.3 討論45-47
• 2.3.1 BnGS 基因家族序列特征45
• 2.3.2 BnGS 基因系統(tǒng)進(jìn)化45
• 2.3.3 苧麻和豆科 GS 基因的關(guān)系45-46
• 2.3.4 BnGS2 等位基因的應(yīng)用46-47
• 第三章 苧麻 GS 基因家族在不同部位和發(fā)育階段的表達(dá)分析47-63
• 3.1 材料和方法47-52
• 3.1.1 試驗(yàn)材料47
• 3.1.2 儀器和試劑47
• 3.1.3 樣品采集47
• 3.1.4 苧麻 RNA 提取47
• 3.1.5 cDNA 合成47-48
• 3.1.6 BnGS 基因 Q-PCR 引物篩選48-49
• 3.1.7 BnGS 基因 PCR 擴(kuò)增49-50
• 3.1.8 BnGS 基因表達(dá)模式分析50
• 3.1.9 BnGS 和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制備50-52
• 3.1.10 數(shù)據(jù)分析52
• 3.2 試驗(yàn)結(jié)果52-60
• 3.2.1 不同部位 RNA 的提取52-53
• 3.2.2 BnGS 基因 Q-PCR 引物篩選53
• 3.2.3 BnGS 基因 PCR 擴(kuò)增53-54
• 3.2.4 內(nèi)參基因 PCR 擴(kuò)增54-55
• 3.2.5 BnGS 和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線55-57
• 3.2.6 BnGS 和內(nèi)參基因熔解曲線57-59
• 3.2.7 BnGS 基因不同部位和發(fā)育階段表達(dá)模式59-60
• 3.3 討論60-63
• 3.3.1 熒光定量 PCR 的優(yōu)點(diǎn)60-61
• 3.3.2 熒光定量 PCR 對(duì)引物的要求61
• 3.3.3 BnGS 基因家族的表達(dá)模式及功能分析61-63
• 第四章 苧麻 BnGS1-2 基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲取63-82
• 4.1 材料和方法63-71
• 4.1.1 試驗(yàn)材料63
• 4.1.2 儀器和試劑63
• 4.1.3 試劑的配制63-64
• 4.1.4 培養(yǎng)基的配制64-65
• 4.1.5 RNA 提取和 cDNA 合成65
• 4.1.6 pBI121 載體提取65-66
• 4.1.7 pBI121 載體線性化66
• 4.1.8 BnGS1-2 基因 PCR 擴(kuò)增66
• 4.1.9 擴(kuò)增產(chǎn)物純化66
• 4.1.10 BnGS1-2 基因與載體重組連接66-67
• 4.1.11 重組載體的轉(zhuǎn)化67
• 4.1.12 超量表達(dá)載體的提取67
• 4.1.13 超量表達(dá)載體的檢測(cè)67
• 4.1.14 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備67-68
• 4.1.15 超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌68
• 4.1.16 煙草苗的培養(yǎng)68
• 4.1.17 農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草遺傳轉(zhuǎn)化68-69
• 4.1.18 轉(zhuǎn)基因植株 PCR 檢測(cè)69-70
• 4.1.19 煙草 RNA 的提取70-71
• 4.1.20 轉(zhuǎn)基因植株 Q-PCR 檢測(cè)71
• 4.2 試驗(yàn)結(jié)果71-80
• 4.2.1 RNA 的提取71-72
• 4.2.2 pBI121 載體的提取72
• 4.2.3 BnGS1-2 基因 PCR 擴(kuò)增72-73
• 4.2.4 超量表達(dá)載體的構(gòu)建73-76
• 4.2.5 超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌76
• 4.2.6 煙草葉片轉(zhuǎn)化植株再生76-77
• 4.2.7 煙草 DNA 的提取77-78
• 4.2.8 抗性植株 PCR 檢測(cè)78-79
• 4.2.9 轉(zhuǎn)基因植株 Q-PCR 檢測(cè)79-80
• 4.3 討論80-82
• 4.3.1 GS 基因超量表達(dá)載體構(gòu)建的應(yīng)用80
• 4.3.2 BnGS 基因超量表達(dá)載體的應(yīng)用80-81
• 4.3.3 同源重組技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)81
• 4.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的應(yīng)用81-82
• 第五章 超量表達(dá) BnGS1-2 基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草氮代謝的影響82-93
• 5.1 材料和方法82-86
• 5.1.1 試驗(yàn)材料82
• 5.1.2 儀器和試劑82
• 5.1.3 試劑的配制82-83
• 5.1.4 株高、鮮重及葉片數(shù)測(cè)定83
• 5.1.5 水溶性蛋白含量的測(cè)定83
• 5.1.6 游離 NH_4~+含量的測(cè)定83
• 5.1.7 游離 NO_3~-含量測(cè)定83-84
• 5.1.8 總氮含量的測(cè)定84
• 5.1.9 葉綠素含量的測(cè)定84
• 5.1.10 GS 活性的測(cè)定84
• 5.1.11 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備84-85
• 5.1.12 游離 NH_4~+標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備85
• 5.1.13 游離 NO_3~-標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備85-86
• 5.1.14 數(shù)據(jù)分析86
• 5.2 試驗(yàn)結(jié)果86-91
• 5.2.1 株高、鮮重及葉片數(shù)86-87
• 5.2.2 游離 NO_3~-的含量87
• 5.2.3 游離 NH_4~+的含量87-88
• 5.2.4 總氮含量88-89
• 5.2.5 水溶性蛋白含量89
• 5.2.6 葉綠素含量89-90
• 5.2.7 GS 酶活性90
• 5.2.8 游離 NH_4~+、NO_3~-和 BAS 標(biāo)準(zhǔn)曲線90-91
• 5.3 討論91-93
• 5.3.1 BnGS 基因功能分析91-92
• 5.3.2 超量表達(dá) BnGS1-2 基因煙草生長(zhǎng)特性92
• 5.3.3 超量表達(dá) BnGS1-2 基因煙草代謝特征92-93
• 第六章 結(jié)論93-96
• 6.1 主要研究結(jié)果93-94
• 6.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)94
• 6.3 今后研究的方向和目標(biāo)94-96
• 參考文獻(xiàn)96-106
• 致謝106-107
• 作者簡(jiǎn)歷107-108

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1055521