本文關(guān)鍵詞：棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因的克隆及特征分析

  更多相關(guān)文章： 棉鈴蟲 糖基轉(zhuǎn)移酶 Bt抗性 分子克隆 亞細胞定位

【摘要】：鞘糖脂(Glycosphingolipids,GSLs)在諸如細胞識別、細胞分化和細胞發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用,同時它還是很多細菌毒素的受體,例如霍亂弧菌、痢疾桿菌。糖基轉(zhuǎn)移酶是GSLs合成的催化酶,相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶基因(bre)的變異已經(jīng)在線蟲中被證實與Bt抗性有關(guān)。在昆蟲中,糖基轉(zhuǎn)移酶具有很大的類群,相關(guān)功能及變異的發(fā)生具有很大的不確定性,它不僅是鞘糖脂合成的催化酶,同時可能在鈣粘蛋白(Cadherin,CAD)、氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)、堿性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase,ALP)和糖蛋白的修飾過程中發(fā)揮作用,所以糖基化變異可能不僅僅針只對一種Bt毒素受體,可能會同時影響幾種重要的結(jié)合受體。本研究綜合運用分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù),首次克隆獲得Harmbre2-4 ORF全長序列并初步研究了棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-5的功能,主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1、利用RT-PCR及RACE技術(shù)克隆獲得了棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-4的ORF全長序列并提交GenBank。預(yù)測Harmbre2(GenBank KR362875)、Harmbre3(GenBank KR362876)和Harmbre4(GenBank KR362877)的ORF全長序列長度分別為1011bp、1377bp和1275bp;分別編碼336、458和424個氨基酸;分子量分別為38、52和48kDa;等電點分別為8.75、8.62和8.90。氨基酸序列分析顯示HarmBre2-4中只有HarmBre4有信號肽序列。HarmBre2沒有跨膜區(qū),而HarmBre3和HarmBre4分別有5個和1個跨膜區(qū);每個氨基酸序列中都包含對該類糖基轉(zhuǎn)移酶的催化起重要作用的保守序列。HarmBre3和家蠶(Bombyx mori)的Bre3(GenBank NP_001243979.1)的相似度高達86%,和小菜蛾(Plutella xylostella)的Bre3(GenBank ADB79796.1)的相似度達到83%。HarmBre2和HarmBre4也和鱗翅目其他害蟲的該類基因氨基酸序列具有很高的相似度。2、運用qPCR分析了Harmbre2-5在棉鈴蟲體內(nèi)的時空表達譜。結(jié)果顯示在棉鈴蟲不同發(fā)育階段中,Harmbre2、Harmbre3和Harmbre5在卵中表達量較高,Harmbre3和Harmbre4在成蟲階段表達量也較高,Harmbre2-5在棉鈴蟲幼蟲階段和蛹期的表達量相對較低,而且在不同的幼蟲階段和蛹期的表達量沒有顯著性差異。通過分析Harmbre2-5在棉鈴蟲4齡幼蟲不同組織中的表達水平差異顯示:這四個基因在棉鈴蟲腸中的表達量都較低,尤其是在中腸中。Harmbre2在馬氏管中表達量較高;而在其他組織中表達量都比較低,且它們之間沒有顯著性差異。Harmbre3在頭部和圍食膜中表達量較高;Harmbre4在馬氏管中表達量較高;Harmbre5也相類似,在圍食膜和馬氏管中表達量較高。3、通過細胞水平實驗對Harmbre2、3和5的功能進行研究。結(jié)果顯示Harmbre2、Harmbre3和Harmbre5表達的蛋白均定位在高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞質(zhì)的細胞器內(nèi),而在細胞核內(nèi)沒有分布。4、通過RNAi技術(shù)干擾Harmbre2-5基因的表達,利用qPCR技術(shù)檢測沉默效率。結(jié)果顯示注射靶標基因的siRNA后,Harmbre2的基因表達水平下降30%左右,Harmbre3-5的基因表達水平下降50%左右。5、通過RT-PCR技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)分析Harmbre2-5在棉鈴蟲抗感品系間的基因結(jié)構(gòu)和基因表達水平差異。結(jié)果顯示Harmbre3-5在棉鈴蟲LF系列抗感品系間的基因結(jié)構(gòu)和表達水平?jīng)]有差異,Harmbre2在棉鈴蟲LF系列低抗品系里的表達量顯著高于敏感品系,而且其基因結(jié)構(gòu)的5′UTR區(qū),抗性品系與敏感品系相比缺失幾個堿基,5′UTR區(qū)有轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達的功能,推測這種差異可能與棉鈴蟲Bt抗性有關(guān)。以上結(jié)果表明,棉鈴蟲bre基因在卵和成蟲階段高表達,在幼蟲階段和蛹期表達量較低,這表明Harmbre可能與棉鈴蟲的生育力和進化有關(guān);同時在馬氏管、圍食膜和頭部表達量較高,而在腸中尤其是中腸中表達量很低,表明Harmbre可能在棉鈴蟲的細胞生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能方面發(fā)揮重要作用。細胞水平實驗表明糖基轉(zhuǎn)移酶主要分布在核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞質(zhì)部位�？垢衅废挡町惙治霭l(fā)現(xiàn)Harmbre2在低抗棉鈴蟲體內(nèi)的表達量較高,且在抗性品系中,其基因的5′UTR區(qū)也存在幾個堿基的變異,推測Harmbre2的表達上調(diào)或者基因突變可能引起棉鈴蟲對Cry1Ac的低水平抗性。本研究對棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因的功能做了初步研究,為下一步研究其明確功能及其與棉鈴蟲Bt抗性的關(guān)系奠定了基礎(chǔ),旨在進一步發(fā)掘棉鈴蟲Bt抗性的新機制。
【關(guān)鍵詞】：棉鈴蟲 糖基轉(zhuǎn)移酶 Bt抗性 分子克隆 亞細胞定位
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433.4
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 引言15-21
• 1.1 鞘糖脂15-17
• 1.1.2 鞘糖脂的功能15-16
• 1.1.3 合成鞘糖脂的糖基轉(zhuǎn)移酶16-17
• 1.2 棉鈴蟲Bt抗性機制及糖基轉(zhuǎn)移酶基因介導(dǎo)的Bt抗性機制研究17-20
• 1.2.1 棉鈴蟲Bt抗性機制的研究17-19
• 1.2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因介導(dǎo)的Bt抗性機制19-20
• 1.3 本研究的目的與意義20-21
• 第二章 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-4 的克隆和序列分析21-37
• 2.1 實驗材料21-22
• 2.1.1 供試昆蟲21
• 2.1.2 主要試劑21-22
• 2.1.3 儀器設(shè)備22
• 2.2 主要方法22-29
• 2.2.1 棉鈴蟲總RNA的提取22-23
• 2.2.2 第一條cDNA鏈的合成23-24
• 2.2.3 RACE-PCR所需cDNA第一鏈的合成24
• 2.2.4 PCR反應(yīng)24-27
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物純化27-28
• 2.2.6 連接反應(yīng)28
• 2.2.7 轉(zhuǎn)化反應(yīng)28-29
• 2.2.8 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建29
• 2.3 結(jié)果與分析29-36
• 2.3.1 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-4 的克隆及序列分析29-33
• 2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建33-36
• 2.4 本章討論36-37
• 第三章 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-5 的時空表達譜分析37-44
• 3.1 實驗材料37-38
• 3.1.1 供試昆蟲37
• 3.1.2 主要試劑37
• 3.1.3 儀器設(shè)備37-38
• 3.2 主要方法38-40
• 3.2.1 棉鈴蟲不同組織和不同齡期總RNA的提取38
• 3.2.2 實時熒光定量PCR所用第一鏈cDNA的合成38
• 3.2.3 熒光定量PCR分析38-40
• 3.2.4 數(shù)據(jù)分析40
• 3.3 結(jié)果與分析40-43
• 3.3.1 RNA質(zhì)量檢測40
• 3.3.2 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-5 在棉鈴蟲不同齡期的表達差異40-41
• 3.3.3 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-5 在棉鈴蟲不同組織的表達差異41-43
• 3.4 本章討論43-44
• 第四章 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶HarmBre2、3 和5的亞細胞定位44-51
• 4.1 實驗材料44-45
• 4.1.1 供試昆蟲44
• 4.1.2 主要試劑44-45
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備45
• 4.2 主要方法45-49
• 4.2.1 引物設(shè)計和PCR擴增45-46
• 4.2.2 PCR產(chǎn)物純化及轉(zhuǎn)化克隆載體46
• 4.2.3 融合表達載體的構(gòu)建46-47
• 4.2.4 菌種保存47
• 4.2.5 質(zhì)粒的提取47-48
• 4.2.6 Hi5細胞48
• 4.2.7 重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TH48
• 4.2.8 制片48-49
• 4.3 結(jié)果與分析49-50
• 4.3.1 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶HarmBre2、3 和5的亞細胞定位49-50
• 4.4 本章討論50-51
• 第五章 棉鈴蟲糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-5 的RNAi研究51-55
• 5.1 實驗材料51-52
• 5.1.1 供試昆蟲51
• 5.1.2 主要試劑51
• 5.1.3 儀器設(shè)備51-52
• 5.2 主要方法52-53
• 5.2.1 siRNA的合成與稀釋52
• 5.2.2 siRNA的注射及其沉默效率的檢測52
• 5.2.3 生物測定52
• 5.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析52-53
• 5.3 結(jié)果與分析53-54
• 5.3.1 熒光定量PCR檢測siRNA沉默效率53-54
• 5.3.2 Harmbre基因沉默后對棉鈴蟲Bt抗性的影響54
• 5.4 本章討論54-55
• 第六章 Harmbre2-5 在棉鈴蟲抗感品系間的結(jié)構(gòu)和表達水平差異分析55-59
• 6.1 實驗材料55-56
• 6.1.1 供試昆蟲55
• 6.1.2 主要試劑55
• 6.1.3 儀器設(shè)備55-56
• 6.2 主要方法56-57
• 6.2.1 Harmbre2-5 在棉鈴蟲抗感品系間的基因結(jié)構(gòu)差異分析56
• 6.2.2 Harmbre2-5 在棉鈴蟲抗感品系間的基因表達差異分析56-57
• 6.2.3 數(shù)據(jù)處理57
• 6.3 結(jié)果與分析57-58
• 6.3.1 Harmbre2-5 在棉鈴蟲抗感品系間的基因結(jié)構(gòu)差異分析57
• 6.3.2 Harmbre2-5 在棉鈴蟲抗感品系間的基因表達差異分析57-58
• 6.4 本章討論58-59
• 第七章 全文結(jié)論59-61
• 7.1 主要結(jié)論59
• 7.2 研究展望59-61
• 參考文獻61-68
• 致謝68-69
• 作者簡介69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁革梅,譚維嘉,郭予元;人工飼養(yǎng)棉鈴蟲技術(shù)的改進[J];植物保護;1999年02期

，

本文編號：648230