本文關(guān)鍵詞：核盤菌病毒多樣性及兩個(gè)新型RNA病毒分子特性分析

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【摘要】：核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一種重要的植物病原真菌,具有廣泛的地理分布和多樣化的寄主范圍。真菌病毒可以引起植物病原真菌的弱毒特性,具有防治植物真菌病害的潛力。核盤菌中存在豐富的病毒資源,利用弱毒相關(guān)病毒防治核盤菌,是菌核病新的潛在生物防治策略之一。本研究通過篩選核盤菌異常菌株,利用高通量測序等技術(shù)對核盤菌攜帶病毒多樣性進(jìn)行分析,獲得了以下研究結(jié)果。對采集自湖南省、黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)的1800份核盤菌菌核進(jìn)行純培養(yǎng),篩選獲得菌落形態(tài)異常的菌株125株。生物學(xué)測定結(jié)果顯示篩選的大部分菌株生長速度緩慢,致病力出現(xiàn)不同程度的衰退。高通量測序分析表明125株異常菌株中攜帶的病毒種類豐富,且多數(shù)為未曾報(bào)道或分類地位不確定的新病毒。病毒核酸類型有正單鏈RNA(+ssRNA)病毒、負(fù)單鏈RNA(-ssRNA)病毒、雙鏈RNA(dsRNA)病毒、單鏈DNA(ss DNA)病毒,其中ss RNA病毒占80%,dsRNA病毒占18%。除裸露病毒科病毒外,共獲得78個(gè)病毒單一序列信息,隸屬于19個(gè)已知病毒科和未分類病毒科。菌株230氣生菌絲發(fā)達(dá),不產(chǎn)生菌核,油菜葉片上不形成病斑,是一株典型弱毒菌株。從中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的多股負(fù)義鏈RNA病毒,命名為Sclerotinia sclerotiorum Mirafiore lettuce virus like(SsMi LV)。SsMi LV-RNA1基因組為7832 nt,包含兩個(gè)推定的開放閱讀框(open reading frame,ORF),ORF2編碼一個(gè)分子量為269KD的假定蛋白,該假定蛋白具有RdRp保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該病毒是蛇形病毒科的新成員,但在遺傳進(jìn)化上與已報(bào)道的蛇形病毒科(Ophioviridae)病毒存在一定遺傳距離,與真菌立枯絲核菌中發(fā)現(xiàn)的真菌病毒聚成一簇。據(jù)此研究結(jié)果,建議將蛇形病毒科分成兩個(gè)不同的屬,一個(gè)寄主為植物,另一個(gè)寄主為真菌,以便更好地區(qū)分不同病毒的特點(diǎn)。弱毒菌株767生長速度緩慢,產(chǎn)生黃色色素,不形成菌核,致病力喪失。初步研究發(fā)現(xiàn)菌株767含有一種新型RNA病毒,命名為Sclerotinia sclerotiorum Norovirus(SsNorV),其RdRp與Bat norovirus具有24%相似性。SsNorV的基因組為11024 nt,編碼兩個(gè)ORF,含有一個(gè)RdRp保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該病毒與星狀病毒科聚成一簇,但獨(dú)立形成一支,建議以該病毒為模式種建立一個(gè)新的病毒屬。SsMiLV和SsNorV可以通過菌絲接觸進(jìn)行水平傳播,但SsMiLV僅可以傳播到菌株1980中,且傳播效率很低僅為5%;而SsNorV可以傳播至Ep-1PNA367和1980中,且傳播效率較高為75%。
【關(guān)鍵詞】：核盤菌 真菌病毒 高通量測序 真菌病毒多樣
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S432.44;S476
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞表11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1 核盤菌危害及防治12-14
• 1.1 核盤菌與菌核病12
• 1.2 作物菌核病的防治12-14
• 2 真菌病毒的研究進(jìn)展14-24
• 2.1 真菌病毒的分類14-19
• 2.1.1 真菌雙鏈RNA病毒概述14-16
• 2.1.2 真菌正單鏈RNA病毒概述16-18
• 2.1.3 真菌負(fù)單鏈RNA病毒18
• 2.1.4 真菌DNA病毒18-19
• 2.1.5 未分類病毒19
• 2.2 核盤菌中已報(bào)道的病毒19-22
• 2.3 高通量測序技術(shù)與病毒資源挖掘22
• 2.4 蛇形病毒科22
• 2.5 真菌病毒與寄主互作22-23
• 2.6 真菌病毒與生物防治23-24
• 3 本研究的目的與意義24-25
• 第二章 核盤菌病毒多樣性分析25-40
• 1 材料與方法25-27
• 1.1 材料和培養(yǎng)基25-26
• 1.1.1 材料25
• 1.1.2 培養(yǎng)基25
• 1.1.3 供試植物25-26
• 1.2 方法26-27
• 1.2.1 核盤菌菌株的分離26
• 1.2.2 菌落形態(tài)觀察26
• 1.2.3 生長速度測定26
• 1.2.4 致病力測定26
• 1.2.5 菌株總RNA的提取26-27
• 1.2.6 高通量測序27
• 1.2.7 序列分析27
• 2．結(jié)果與分析27-38
• 2.1 異常菌株篩選及菌落形態(tài)27-29
• 2.2 生長速度測定29
• 2.3 致病力測定29-30
• 2.4. 菌株總RNA提取及質(zhì)量檢測30-31
• 2.5 高通量測序結(jié)果分析31-38
• 3. 討論38-40
• 第三章 核盤菌菌株230中真菌病毒的全長cDNA克隆及生物學(xué)特性研究40-53
• 1 材料與方法40-45
• 1.1 材料40-42
• 1.1.1 菌株40
• 1.1.2 培養(yǎng)基40-41
• 1.1.3 試劑及藥品41-42
• 1.1.4 載體與引物42
• 1.1.5 儀器與設(shè)備42
• 1.2 方法42-45
• 1.2.1 菌絲培養(yǎng)和收集42
• 1.2.2 菌株230中dsRNA的提取42-43
• 1.2.3 菌株230總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄43
• 1.2.4 病毒的cDNA序列克隆策略43-45
• 1.2.5 序列拼接及分析45
• 1.2.6 病毒在不同菌株間的水平傳播45
• 2 結(jié)果與分析45-51
• 2.1 菌株230中含有負(fù)單鏈RNA病毒45-46
• 2.2 菌株230菌落異常46
• 2.3 菌株230生長緩慢46
• 2.4 致病力測定46-47
• 2.5 SsMiLV全長cDNA克隆與序列分析47-50
• 2.6 SsMiLV的水平傳播特性50-51
• 3 結(jié)論與討論51-53
• 第四章 核盤菌菌株767中真菌病毒的全長cDNA克隆及生物學(xué)特性研究53-61
• 1.材料與方法53-54
• 1.1 材料53
• 1.1.1 菌株53
• 1.2 方法53-54
• 1.2.1 菌絲培養(yǎng)和收集53
• 1.2.2 菌株767中dsRNA的提取53
• 1.2.3 菌株767總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄53
• 1.2.4 病毒的cDNA序列克隆策略53
• 1.2.5 序列拼接及分析53-54
• 1.2.6 病毒在不同菌株間的水平傳播54
• 2.結(jié)果與分析54-59
• 2.1 菌株767中含有新型RNA病毒54-55
• 2.2 菌株767菌落異常55
• 2.3 菌株767生長緩慢55
• 2.4 致病力測定55-56
• 2.5 SsNorV全長cDNA克隆與序列分析56-59
• 2.6 SsNorV的水平傳播特性59
• 3.討論59-61
• 結(jié)論與展望61-63
• 1 結(jié)論61-62
• 2 前景與展望62-63
• 附錄63-65
• 參考文獻(xiàn)65-74
• 致謝74

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本文編號：514907