本文關(guān)鍵詞：菜粉蝶不同發(fā)育階段mRNA與miRNA轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：菜粉蝶(Pieris rapae),鱗翅目:粉蝶科,農(nóng)業(yè)上是重要的害蟲之一,主要危害十字花科蔬菜。在基礎(chǔ)研究中,菜粉蝶及其重要天敵蝶蛹金小蜂是自體免疫的重要的相互作用模型,然而其基因組尚未測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序亦可為菜粉蝶基因表達(dá)、生物學(xué)以及防治策略提供全局性的視角。故本論文以菜粉蝶不同發(fā)育階段的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)為研究目標(biāo),對(duì)菜粉蝶不同生長(zhǎng)發(fā)育階段構(gòu)建了六個(gè)mRNA庫(kù)和六個(gè)small RNA庫(kù),應(yīng)用illumina測(cè)序,通過基因注釋與發(fā)育轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析,以期獲得菜粉蝶發(fā)育轉(zhuǎn)錄組并挖掘出與發(fā)育有關(guān)的基因。對(duì)于mRNA序列,主要內(nèi)容包括轉(zhuǎn)錄組拼接、轉(zhuǎn)錄組注釋與發(fā)育相關(guān)基因的篩選。首先通過de novo拼接方法,生成了96,069條unigenes序列和196,202條transcripts序列,其N50和轉(zhuǎn)錄本拼接序列的平均長(zhǎng)度達(dá)到2269bp和1206bp。其中31,774(33%)條unigenes序列能顯著性比對(duì)到NCBI中非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),篩選出16500條具有完整的ORF的基因序列。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示同源性序列最多的前五大物種均屬鱗翅目,表明拼接結(jié)果可靠。隨后,將注釋所得基因再次利用GO、COG/KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行深入注釋,發(fā)現(xiàn)849個(gè)基因參與到七條主要的發(fā)育通路,如Hippo、Notch與JAK2等發(fā)育關(guān)鍵基因。在基因表達(dá)水平分析中,兩兩比較菜粉蝶相鄰六個(gè)發(fā)育階段,發(fā)現(xiàn)從卵期到初孵幼蟲期的轉(zhuǎn)變基因表達(dá)水平顯著變化的基因最多;發(fā)現(xiàn)表皮蛋白基因的表達(dá)水平在菜粉蝶不同的發(fā)育階段變化尤其頻繁,共有20余個(gè)表皮蛋白基因在任意的相鄰階段表達(dá)水平差異顯著,推測(cè)與菜粉蝶發(fā)育過程中的蛻皮調(diào)控機(jī)制有關(guān);此外,在不同發(fā)育階段均鑒定到階段特異性表達(dá)的基因,這些基因可作為發(fā)育階段的分子標(biāo)簽;最后,通過對(duì)熱激蛋白同源進(jìn)化與表達(dá)共分析,顯示同源相近的hsp基因具有相同或相近的表達(dá)模式。針對(duì)smrna序列,主要研究?jī)?nèi)容包括小rna的比對(duì)注釋,保守與新mirna成熟體的鑒定,mirna前體序列的預(yù)測(cè),與表達(dá)水平研究。篩選與質(zhì)控獲得53,508,931條序列長(zhǎng)度在18-24nt高質(zhì)量reads,去冗余后為121,695條特異序列,78,316條特異序列分別注釋到非編碼rna數(shù)據(jù)庫(kù)(ncbi和rfam)的rrna,trna,snrna,snorna,sirna,mirna等序列。其中以rrna占比最高,其次為trna和mirna。初選為mirna的序列再次比對(duì)到mirbase數(shù)據(jù)庫(kù),并去除冗余后,鑒定到143條保守mirna序列,其中54個(gè)mirna具有前體序列。另外,鑒定到21條新的成熟mirna,其中18條含mirna前體序列,3條pre-mirna序列包含mirna*。差異表達(dá)分析的結(jié)果顯示有78條成熟mirna序列的表達(dá)水平在至少兩兩相鄰發(fā)育階段之間存在顯著性差異,且大部分出現(xiàn)在從卵期到初孵幼蟲期。對(duì)于mirna調(diào)控基因表達(dá)研究,主要內(nèi)容包括靶基因預(yù)測(cè)、篩選參與發(fā)育代謝通路的靶基因與表達(dá)相關(guān)性分析。以拼接轉(zhuǎn)錄本為參考序列,應(yīng)用rnahybrid和miranda軟件分別預(yù)測(cè)出6,198和6,959個(gè)潛在miRNA靶位點(diǎn),涉及5,589個(gè)靶基因,這些靶基因均注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)。此外,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中與昆蟲發(fā)育相關(guān)的代謝通路以及差異表達(dá)的mi RNA和靶基因表達(dá)量的高度負(fù)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)小于-0.8)推斷出可能與菜粉蝶的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的20條miRNA序列與37個(gè)靶基因。本論文通過RNA-seq技術(shù)首次獲得了對(duì)菜粉蝶發(fā)育轉(zhuǎn)錄組,這是鱗翅目昆蟲第一個(gè)非模式生物的發(fā)育轉(zhuǎn)錄組,獲得了具有完整編碼框的基因16500個(gè),發(fā)現(xiàn)從卵期到初孵幼蟲期過程中基因與miRNA表達(dá)變化劇烈,同時(shí)發(fā)現(xiàn)20余個(gè)表皮蛋白基因表達(dá)水平與發(fā)育緊密相關(guān),揭示出同源性更高的熱激蛋白具有相近表達(dá)水平模式,獲得143條保守性miRNA,新發(fā)現(xiàn)21個(gè)miRNA,這些工作為后續(xù)菜粉蝶的發(fā)育生物學(xué)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：菜粉蝶 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 生長(zhǎng)發(fā)育 miRNA 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 第一章 緒論11-23
• 1 DNA測(cè)序技術(shù)11-14
• 2 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析14-17
• 3 昆蟲發(fā)育相關(guān)基因研究概述17-20
• 4 菜粉蝶的研究現(xiàn)狀20-22
• 5 科學(xué)問題的提出與解決方案22-23
• 第二章 材料與方法23-29
• 1 實(shí)驗(yàn)材料的采集及飼養(yǎng)23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-29
• 第三章 結(jié)果分析與討論29-73
• 1 RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)29
• 2 mRNA測(cè)序分析29-42
• 3 Small RNA測(cè)序分析42-64
• 4 miRNA與靶基因之間的作用關(guān)系64-73
• 第四章 總結(jié)與展望73-77
• 第五章 參考文獻(xiàn)77-83
• 課題基金來源83
• 發(fā)表論文情況83-84
• 致謝84

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Prophenoloxidase from Pieris rapae:gene cloning,activity,and transcription in response to venom/calyx fluid from the endoparasitoid wasp Cotesia glomerata[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2011年02期

  本文關(guān)鍵詞：菜粉蝶不同發(fā)育階段mRNA與miRNA轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：475039