本文關(guān)鍵詞：苜蓿夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶cDNA的克隆及特性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛋白酶(Protease)主要參與蛋白質(zhì)的合成與降解,是所有生物體維持自身生長發(fā)育必不可少的一種酶。絲氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是蛋白酶的重要成員,是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶。研究表明,昆蟲絲氨酸蛋白酶參與昆蟲消化、發(fā)育、先天免疫反應(yīng)和組織重建等重要的生理過程。由于在昆蟲消化和先天免疫中所起的重要作用,昆蟲絲氨酸蛋白酶已經(jīng)成為國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室的研究熱點(diǎn),但當(dāng)前對昆蟲絲氨酸蛋白酶的研究主要以黑腹果蠅Drosophila melanogaster和家蠶Bombyx mori等模式昆蟲居多,而對重要的農(nóng)業(yè)害蟲研究相對較少。苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca是大豆上重要的食葉害蟲,有時(shí)會引發(fā)局部嚴(yán)重危害,已成為主要的大豆害蟲之一。本試驗(yàn)以苜蓿夜蛾H.viriplaca為研究對象,克隆得到苜蓿夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶基因,并命名為HvSP,該基因已登錄GenBank,登錄號為KT907053。用大腸桿菌E.coli表達(dá)系統(tǒng)對其進(jìn)行表達(dá),再對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行變性、純化與復(fù)性,并以BTEE為底物進(jìn)行活性測定。同時(shí)對HvSP基因的m RNA在苜蓿夜蛾多個(gè)組織中的特異性表達(dá)進(jìn)行了研究,最后通過體外注射雙鏈RNA對HvSP基因的RNA干擾效果進(jìn)行檢測。本文主要研究結(jié)果如下:(1)HvSP基因長1017 bp,開放閱讀框?yàn)?86 bp,編碼295個(gè)氨基酸,含有34 bp和95 bp的5'和3'非編碼區(qū),N端含有17個(gè)氨基酸組成的信號肽。由HvSP基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為30.8 kDa,等電點(diǎn)為8.27。NCBI Blast搜索發(fā)現(xiàn)HvSP推導(dǎo)出的氨基酸序列與鱗翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列同源性達(dá)到46%~92%,其中同源性較高的均為胰凝乳蛋白酶,推斷本試驗(yàn)獲得的絲氨酸蛋白酶為胰凝乳蛋白酶。(2)將本試驗(yàn)得到的HvSP基因與原核表達(dá)載體pET21b連接,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞里,用大腸桿菌E.coli表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá),目的菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果顯示,含目的基因的HvSP重組質(zhì)粒在相對分子質(zhì)量接近30.8 kDa處,有一條明顯的目的條帶,與預(yù)測的蛋白分子量相近,而未插入目的基因的p ET21b空載體未檢測到目的條帶,說明成功表達(dá)外源蛋白。再對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行變性、純化與復(fù)性,并以BTEE為底物進(jìn)行活性測定。酶活性測定結(jié)果表明在0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液中,p H為8.5時(shí),復(fù)性的重組蛋白活性達(dá)到最高,為28.7 U/m L。(3)熒光定量PCR結(jié)果表明,前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體都發(fā)現(xiàn)了HvSP基因的mRNA表達(dá),但在唾腺中并沒有發(fā)現(xiàn)。和其他組織相比,HvSP基因在中腸中的表達(dá)量最高,是脂肪體表達(dá)量的14倍,并且與其他組織差異顯著(p0.05),這表明HvSP基因主要存在于苜蓿夜蛾的中腸組織中。(4)HvSP基因的RNA干擾結(jié)果表明,72 h后,注射了2μL含2μg/μL的dsHvSP的苜蓿夜蛾幼蟲相比對照組,基因表達(dá)量下降了65%,本試驗(yàn)說明,通過RNA干擾技術(shù)成功沉默HvSP基因。
【關(guān)鍵詞】：苜蓿夜蛾 絲氨酸蛋白酶 克隆 原核表達(dá) RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433.4
【目錄】：

• 摘要10-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-18
• 1.1 苜蓿夜蛾13
• 1.2 鱗翅目昆蟲消化酶13
• 1.3 昆蟲絲氨酸蛋白酶的研究進(jìn)展13-14
• 1.4 昆蟲絲氨酸蛋白酶的分類與結(jié)構(gòu)14-16
• 1.4.1 昆蟲胰蛋白酶14-15
• 1.4.2 昆蟲胰凝乳蛋白酶15-16
• 1.5 昆蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑16-17
• 1.6 本研究的目的與意義17-18
• 2 材料與方法18-38
• 2.1 試驗(yàn)材料18-20
• 2.1.1 供試?yán)ハx18
• 2.1.2 菌株與質(zhì)粒18
• 2.1.3 主要分子生物學(xué)試劑18
• 2.1.4 所需溶液的配制18-19
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備19-20
• 2.2 苜蓿夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶基因的克隆20-29
• 2.2.1 RNA提取20
• 2.2.2 cDNA第一鏈的合成20-21
• 2.2.3 絲氨酸蛋白酶基因cDNA序列片段克隆21-24
• 2.2.4 利用RACE克隆基因的3'cDNA序列和5'cDNA序列24-29
• 2.2.5 絲氨酸蛋白酶全長cDNA序列的獲得29
• 2.3 序列分析29-30
• 2.3.1 序列相似性分析29
• 2.3.2 核苷酸序列分析29
• 2.3.3 蛋白質(zhì)基本性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析29-30
• 2.3.4 多重比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析30
• 2.4 絲氨酸蛋白酶基因的原核表達(dá)及活性測定30-34
• 2.4.1 絲氨酸蛋白酶基因cDNA序列的PCR擴(kuò)增30-31
• 2.4.2 酶切反應(yīng)31
• 2.4.3 大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建31-32
• 2.4.4 絲氨酸蛋白酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE32-33
• 2.4.5 重組蛋白變性、純化與復(fù)性33-34
• 2.4.6 重組蛋白的活性測定34
• 2.5 絲氨酸蛋白酶基因在苜蓿夜蛾不同組織中的特異性表達(dá)34-36
• 2.5.1 絲氨酸蛋白酶基因在不同組織的表達(dá)34-35
• 2.5.2 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)35
• 2.5.3 熒光定量PCR的反應(yīng)體系和步驟35
• 2.5.4 熒光定量PCR的數(shù)據(jù)處理35-36
• 2.6 絲氨酸蛋白酶基因的RNAi研究36-38
• 2.6.1 設(shè)計(jì)引物RNAi引物36
• 2.6.2 體外合成dsRNA36-37
• 2.6.3 dsRNA的純化37
• 2.6.4 dsRNA的注射37
• 2.6.5 RNA干擾效果的檢測37-38
• 3 結(jié)果與分析38-54
• 3.1 Hv SP基因cDNA的克隆38-39
• 3.1.1 苜蓿夜蛾總RNA的提取38
• 3.1.2 HvSPcDNA的克隆38-39
• 3.2 HvSP基因cDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析39-43
• 3.2.1 HvSP基因cDNA的序列分析39-40
• 3.2.2 HvSP基因同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析40-43
• 3.3 HvSP基因推導(dǎo)的氨基酸特征分析43-46
• 3.3.1 苜蓿夜蛾總RNA的提取43
• 3.3.2 信號肽分析43-44
• 3.3.3 氨基酸疏水性分析44-45
• 3.3.4 N-糖基化位點(diǎn)分析45
• 3.3.5 蛋白三維模型構(gòu)建45-46
• 3.4 HvSP基因的原核表達(dá)及活性測定46-49
• 3.4.1 HvSP基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定46-47
• 3.4.2 重組蛋白HvSP-pET21b的誘導(dǎo)表達(dá)47-48
• 3.4.3 重組蛋白的純化、復(fù)性和活性測定48-49
• 3.5 HvSP基因在不同組織的表達(dá)分析49-51
• 3.5.1 熒光定量PCR引物特異性檢驗(yàn)49-51
• 3.5.2 HvSP在不同組織的表達(dá)分析51
• 3.6 RNAi結(jié)果分析51-54
• 3.6.1 dsRNA的合成51-52
• 3.6.2 RNAi處理后HvSP基因表達(dá)量的變化52-54
• 4 討論54-58
• 4.1 HvSP基因的克隆及序列分析54
• 4.2 HvSP基因的原核表達(dá)及活性分析54-55
• 4.3 HvSP基因在不同組織表達(dá)研究55-56
• 4.4 HvSP基因的RNAi研究56-58
• 5 結(jié)論58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67

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6 慕衛(wèi);劉峰;趙德;吳孔明;;14種殺蟲劑對苜蓿夜蛾的毒力比較[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2004年03期

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  本文關(guān)鍵詞：苜蓿夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶cDNA的克隆及特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：471312