本文關(guān)鍵詞：Ha-SRP2基因在棉鈴蟲(chóng)先天性免疫中的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：SRP基因最早在美國(guó)白蛾(Hyphantria cunea)中被發(fā)現(xiàn)和命名(以前被命名為Hdd23),是一種免疫刺激后表達(dá)量上調(diào)的基因。后來(lái)在斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中也鑒定到一個(gè)Hdd23基因的同源基因,研究發(fā)現(xiàn)各種壓力因子(如被寄生蜂寄生、腹部切割、腹部結(jié)扎、低溫,熱脅迫等)能上調(diào)該基因的表達(dá),因此該基因被命名為壓力應(yīng)激肽(stress-responsive peptide,SRP).本研究組前期在棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中也鑒定到一個(gè)SRP基因(命名為Ha-SRP),研究顯示Ha-SRP基因可能通過(guò)調(diào)控酚氧化酶原激活和結(jié)節(jié)反應(yīng)這兩種免疫反應(yīng)而在棉鈴蟲(chóng)先天免疫中起著重要的作用。最近我們從棉鈴蟲(chóng)血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中又鑒定到一個(gè)SRP基因,將其命名為Ha-SRP2(本文中將以前鑒定到的Ha-SRP基因重命名為Ha-SRP1).在本項(xiàng)研究中,我們利用蛋白原核表達(dá)、蛋白體外功能分析和RNA干擾幾種方法較為系統(tǒng)的對(duì)Ha-SRP2基因在棉鈴蟲(chóng)先天性免疫中的功能進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.Ha-SRP2基因的克隆和序列分析：克隆獲得了Ha-SRP2基因的全長(zhǎng)序列,該基因具有一個(gè)360bp的開(kāi)放閱讀框,編碼一個(gè)具有119個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子量為12.799kDa,等電點(diǎn)為6.04。該蛋白含有信號(hào)肽序列,無(wú)跨膜區(qū)序列,表明該蛋白是一種分泌型蛋白。氨基酸序列多重比對(duì)表明棉鈴蟲(chóng)Ha-SRP2與其他鱗翅目昆蟲(chóng)SRP具有較高的相似性。2、組織特異性表達(dá)分析：利用半定量RT-PCR及熒光定量PCR的方法分析了Ha-SRP2基因在棉鈴蟲(chóng)血細(xì)胞、脂肪體、中腸、表皮和馬氏管這五種組織中的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示：該基因在這五種組織中均有表達(dá),其中在血細(xì)胞和馬氏管中的表達(dá)量較高。3、免疫刺激對(duì)棉鈴蟲(chóng)Ha-SRP2基因表達(dá)量的影響：利用熒光定量PCR的方法分析了免疫刺激后棉鈴蟲(chóng)脂肪體和血細(xì)胞這兩種主要免疫組織中Ha-SRP2基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示棉鈴蟲(chóng)脂肪體和血細(xì)胞中Ha-SRP2基因在受到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌免疫刺激后表達(dá)量均有上調(diào),表明Ha-SRP2基因可能與棉鈴蟲(chóng)的先天性免疫有關(guān)。4.Ha-SRP2重組蛋白的原核表達(dá)及純化：克隆Ha-SRP2成熟肽的cDNA序列,與pET-32a原核表達(dá)載體相連接,構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a-Ha-SRP2.將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中并誘導(dǎo)蛋白表達(dá),然后利用鎳柱進(jìn)行純化,得到了純度較高的Ha-SRP2重組蛋白。5.rHa-SRP2的功能分析：(1)rHa-SRP2在體外可以識(shí)別并結(jié)合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌；(2)rHa-SRP2在體外可以促進(jìn)棉鈴蟲(chóng)血漿中酚氧化酶原的激活；(3)rHa-SRP2體內(nèi)可以促進(jìn)棉鈴蟲(chóng)的結(jié)節(jié)反應(yīng)；(4) rHa-SRP2可以結(jié)合到棉鈴蟲(chóng)血細(xì)胞的表面。6、RNA干擾實(shí)驗(yàn)：通過(guò)注射dsHa-SRP2將棉鈴蟲(chóng)血細(xì)胞和脂肪體中Ha-SRP2基因的表達(dá)敲降后,棉鈴蟲(chóng)血淋巴中酚氧化酶活性顯著降低,棉鈴蟲(chóng)結(jié)節(jié)反應(yīng)的能力也受到抑制,進(jìn)而導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)血淋巴對(duì)侵入到血腔中的細(xì)菌的清楚能力顯著下降。綜上所述,上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ha-SRP2基因可能通過(guò)介導(dǎo)酚氧化酶原激活反應(yīng)和結(jié)節(jié)作用而在棉鈴蟲(chóng)的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)節(jié)作用 酚氧化酶原激活 先天性免疫 棉鈴蟲(chóng)
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1. 引言12-18
• 1.1 昆蟲(chóng)先天性免疫12-14
• 1.1.1 昆蟲(chóng)先天性免疫簡(jiǎn)介12
• 1.1.2 細(xì)胞免疫12-13
• 1.1.3 體液免疫13-14
• 1.2 酚氧化酶激活系統(tǒng)與結(jié)節(jié)作用14-16
• 1.3 SRP基因在昆蟲(chóng)先天性免疫中的研究16-17
• 1.4 本研究的意義17-18
• 2. 材料與方法18-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)棉鈴蟲(chóng)18
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)載體和菌種18
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑和藥品19-20
• 2.1.5 試劑配方20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-37
• 2.2.1 棉鈴蟲(chóng)Ha-SRP2基因的克隆及序列分析20-25
• 2.2.2 Ha-SRP2基因的組織特異性表達(dá)分析25-27
• 2.2.3 免疫刺激后Ha-SRP2基因表達(dá)量的變化27-28
• 2.2.4 Ha-SRP2基因的原核表達(dá)及蛋白純化28-31
• 2.2.5 rHa-SRP2的功能實(shí)驗(yàn)31-33
• 2.2.6 RNA干擾實(shí)驗(yàn)33-37
• 3. 結(jié)果與分析37-47
• 3.1 棉鈴蟲(chóng)Ha-SRP2基因的克隆及序列分析37-38
• 3.1.1 Ha-SRP2基因的克隆37
• 3.1.2 Ha-SRP2基因的序列分析37-38
• 3.2 Ha-SRP2基因的組織特異表達(dá)分析38-39
• 3.3 免疫刺激后棉鈴蟲(chóng)Ha-SRP2基因表達(dá)量的變化39-40
• 3.4 Ha-SRP2重組蛋白的原核表達(dá)及蛋白純化40-41
• 3.4.1 pET32a-Ha-SRP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建40-41
• 3.4.2 rHa-SRP2及對(duì)照蛋白rTrx的誘導(dǎo)和純化41
• 3.5 rHa-SRP2的功能實(shí)驗(yàn)41-44
• 3.5.1 菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)41-42
• 3.5.2 結(jié)節(jié)實(shí)驗(yàn)42-43
• 3.5.3 rHa-SRP2與血細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)43
• 3.5.4 酚氧化酶原激活實(shí)驗(yàn)43-44
• 3.6 RNA干擾實(shí)驗(yàn)44-47
• 3.6.1 RNA干擾后的熒光定量分析44-45
• 3.6.2 RNA干擾后酚氧化酶活性實(shí)驗(yàn)45
• 3.6.3 RNA干擾對(duì)棉鈴蟲(chóng)結(jié)節(jié)的影響45-46
• 3.6.4 RNA干擾對(duì)棉鈴蟲(chóng)血淋巴清除細(xì)菌能力的影響46-47
• 4. 討論47-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 論文發(fā)表情況56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊代群;棉鈴蟲(chóng)中肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-C的基因克隆及表達(dá)模式[D];華中師范大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：426855