鐵是微生物在生命活動(dòng)中所必須的元素,它參與了生命活動(dòng)中的大部分代謝過程,如呼吸作用、DNA的合成等。鐵雖然是地殼含量排第四的元素,但它的幾種存在形式,即結(jié)晶態(tài)和非結(jié)晶態(tài)或者Fe3+的氧化物或者氫氧化鐵的復(fù)合物,都是不溶于水的,微生物對于不溶性的鐵的利用率很低。在物競天擇的大環(huán)境下,微生物為了滿足自身生命活動(dòng)的需要,在低鐵的限制環(huán)境下,合成分泌了一種次級代謝產(chǎn)物——鐵載體。鐵載體是一種對三價(jià)鐵離子具有超高螯合作用的小分量有機(jī)化合物,分子量在500-1500Da之間。這種小分子化合物可以從宿主細(xì)胞或者生長環(huán)境中高效地螯合鐵,并通過一系列的傳遞機(jī)制,傳遞到細(xì)胞內(nèi)部,以滿足自身生長需求。 本實(shí)驗(yàn)對菌株Agrobacterium sp. ZX09進(jìn)行了一系列的生理生化實(shí)驗(yàn),并對ZX09進(jìn)行全基因組測序。通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了ZX09基因組上有參與鐵載體分泌過程中非核糖體合成的兩種酶,2,3-二氫-2,3-二羥基苯甲酸甲酯脫氫酶和合成酶的相關(guān)基因。在定位了這兩個(gè)相關(guān)基因之后,對前后的基因序列進(jìn)行推敲,預(yù)測了鐵載體的整個(gè)合成途徑和結(jié)構(gòu)。并通過CAS鐵載體平板實(shí)驗(yàn)和液體實(shí)驗(yàn),證實(shí)了ZX09菌株可...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 研究背景
        1.1.1 鐵元素的特性和生物學(xué)功能
        1.1.2 鐵的穩(wěn)態(tài)形式
        1.1.3 鐵的吸收機(jī)制
        1.1.4 鐵載體的合成和利用
    1.2 鐵載體的分類
    1.3 鐵載體的運(yùn)輸系統(tǒng)
        1.3.1 鐵載體的運(yùn)輸機(jī)制
        1.3.2 鐵受體蛋白
        1.3.3 鐵載體的運(yùn)輸系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制
    1.4 鐵載體的檢測方法
        1.4.1 通用CAS檢測法
        1.4.2 CAS檢測法的改進(jìn)
    1.5 鐵載體的生物學(xué)功能
        1.5.1 鐵載體在臨床方面的應(yīng)用
        1.5.2 鐵載體在工農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用
    1.6 自殺性質(zhì)粒的同源重組方法
        1.6.1 自殺性質(zhì)粒的同源重組
2 生理生化特性
    2.1 試劑與材料
        2.1.1 試劑
        2.1.2 培養(yǎng)基的配置
    2.2 生理生化試驗(yàn)
        2.2.1 菌體菌落形態(tài)觀察
        2.2.3 生長溫度測定
        2.2.4 生長曲線的測定
        2.2.5 適宜pH測定
        2.2.6 適宜鹽度測定
        2.2.7 銨鹽利用
        2.2.8 其他培養(yǎng)基培養(yǎng)
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 菌落形態(tài)
        2.3.2 顯微鏡觀察形態(tài)
        2.3.3 生長曲線
        2.3.4 部分生理生化特性
    2.4 本章小結(jié)
3 生物信息學(xué)分析
    3.1 全基因組測序
    3.2 鐵載體關(guān)聯(lián)的基因簇分析
    3.3 推測合成途徑,預(yù)測產(chǎn)物結(jié)構(gòu)
    3.4 本章討論
4 鐵載體測試實(shí)驗(yàn)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        4.1.1 菌株及對照菌株
        4.1.2 鐵載體檢測(CAS法)所用的試劑
        4.1.3 菌株培養(yǎng)
    4.2 CAS法檢測鐵載體
        4.2.1 平板測試實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.2 液體測試實(shí)驗(yàn)方法
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 鐵載體固體實(shí)驗(yàn)
        4.3.2 鐵載體液體測試
    4.4 本章討論
5 突變體的構(gòu)建及測試
    5.1 材料與儀器
        5.1.1 菌種和質(zhì)粒
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)中主要工具酶及化學(xué)試劑
        5.1.3 引物合成
        5.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液的配置
        5.1.5 主要儀器和設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)思路及流程
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)思路
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)流程圖
        5.2.3 實(shí)驗(yàn)流程
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 Agrobacterium sp.ZX09基因組的提取
        5.3.2 獲得目的片段TatA
        5.3.3 TA克隆產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證
        5.3.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒pEMG-TatA
        5.3.5 重組質(zhì)粒pEMG-TatA電轉(zhuǎn)到ZX09宿主菌中
        5.3.6 同源重組的PCR驗(yàn)證
        5.3.7 突變體測試
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 Agrobacterium sp.ZX09基因組的提取電泳驗(yàn)證
        5.4.2 目的片段TatA的擴(kuò)增回收結(jié)果
        5.4.3 TA克隆結(jié)果
        5.4.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒pEMG-TatA結(jié)果
        5.4.5 同源重組的PCR驗(yàn)證
        5.4.6 突變體的測試
    5.5 本章討論
6 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)



本文編號：4012355