昆蟲病原真菌具有對(duì)環(huán)境無害、寄主范圍廣、可在適當(dāng)時(shí)候形成流行病等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲及城市衛(wèi)生昆蟲的生物防治。但其致死宿主速度慢（4-14d）、對(duì)環(huán)境條件要求高等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了真菌殺蟲劑的推廣和應(yīng)用。真菌致病昆蟲的過程包括孢子附著昆蟲體壁、侵染結(jié)構(gòu)形成、菌絲穿透體壁、真菌在宿主血腔中增殖并擊倒宿主幾個(gè)步驟。在此過程中,昆蟲會(huì)利用其免疫系統(tǒng)進(jìn)行積極的防御,產(chǎn)生吞噬、黑化及抗菌肽合成等免疫反應(yīng),抑制及清除入侵的病原物。研究表明,Toll信號(hào)途徑是昆蟲應(yīng)對(duì)真菌侵染的主要信號(hào)通路。當(dāng)真菌侵染宿主時(shí),會(huì)激活體內(nèi)的Spaetzle蛋白,進(jìn)而活化Toll受體,引起相應(yīng)的免疫反應(yīng)。該信號(hào)途徑受到絲氨酸蛋白酶抑制子（serpin）的負(fù)調(diào)控。在果蠅中,當(dāng)缺乏serpin （Spn43Ac）時(shí),會(huì)引起Toll介導(dǎo)免疫反應(yīng)的組成性活化。因此,我們設(shè)想,將免疫負(fù)調(diào)控因子serpin導(dǎo)入到昆蟲病原真菌中表達(dá),使其在真菌侵染宿主的過程中抑制宿主的免疫反應(yīng),提高真菌在宿主中的增殖速度,從而增強(qiáng)真菌的殺蟲效果。為此,課題組克隆了果蠅的Spn43Ac基因,構(gòu)建了相應(yīng)的真菌表達(dá)載體,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后獲得了球孢白僵菌Bb... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 昆蟲病原真菌的研究概況
    1.2 昆蟲病原真菌的改良及應(yīng)用
        1.2.1 提高昆蟲病原真菌殺蟲毒力
        1.2.2 提高昆蟲病原真菌的抗逆性
        1.2.3 改變昆蟲病原真菌的寄主范圍
    1.3 Serpin蛋白超家族的研究進(jìn)展
        1.3.1 簡介
        1.3.2 Serpin的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.3.3 Serpin的生物學(xué)功能
    1.4 Serpin在昆蟲先天免疫系統(tǒng)中的功能
        1.4.1 昆蟲先天免疫應(yīng)答
        1.4.2 先天性免疫信號(hào)通路
        1.4.3 酚氧化酶(PO)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)介導(dǎo)的昆蟲黑化反應(yīng)
    1.5 研究目的和意義
第二章 引言
    2.1 研究背景和意義
    2.2 技術(shù)路線
第三章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 供試菌株
        3.1.2 生測用蟲
        3.1.3 質(zhì)粒載體
        3.1.4 主要化學(xué)試劑
        3.1.5 主要儀器設(shè)備
        3.1.6 主要緩沖液與配方
        3.1.7 主要培養(yǎng)基
        3.1.8 實(shí)驗(yàn)中使用的引物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Bbsp：Spn43Ac基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化
        3.2.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
        3.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)球孢白僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.2.5 Bbsp：Spn43Ac超量表達(dá)菌株的篩選
        3.2.6 Bbsp：Spn43Ac基因表達(dá)檢測
        3.2.7 Bbsp：Spn43Ac-1菌株菌落形態(tài)的觀察
        3.2.8 觀察Bbsp：Spn43Ac-1菌株在蟬翅上的生長
        3.2.9 毒力測定
        3.2.10 檢測Bbsp：Spn43Ac-1菌株在試蟲血淋巴中蟲菌體的增殖
        3.2.11 原核表達(dá)蛋白pGEX-6p-Spn43Ac載體的構(gòu)建
        3.2.12 GST：Spn43Ac蛋白的原核表達(dá)及純化
        3.2.13 Western Blot
        3.2.14 CDEP-1畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.15 檢測GST：Spn43Ac蛋白對(duì)蛋白酶CDEP-1的影響
        3.2.16 昆蟲血淋巴內(nèi)酚氧化酶(PO)的酶活測定
        3.2.17 檢測GST：Spn43Ac蛋白對(duì)酚氧化酶(PO)活性的影響
        3.2.18 統(tǒng)計(jì)分析
第四章 結(jié)果與分析
    4.1 Bbsp：Spn43Ac基因的真菌表達(dá)載體構(gòu)建
    4.2 超量表達(dá)Bbsp：Spn43Ac轉(zhuǎn)化子的篩選
    4.3 Spn43Ac在轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)分析
    4.4表達(dá)Bbsp:Spn43Ac不會(huì)影響真菌的生長
        4.4.1 Bbsp：Spn43Ac-1菌株的表型分析
        4.4.2 表達(dá)Bbsp：Spn43Ac不會(huì)影響真菌在蟬翅上的萌發(fā)及生長
        4.4.3 GST：Spn43Ac蛋白不會(huì)影響昆蟲體壁降解酶CDEP-1的活性
    4.5 Bbsp:Spn43Ac-1菌株毒力測定結(jié)果
    4.6 真菌在昆蟲血淋巴中的增殖
    4.7 昆蟲血淋巴內(nèi)酚氧化酶(PO)的酶活測定
    4.8 GST：Spn43Ac蛋白對(duì)酚氧化酶(PO)活性的影響
第五章 討論
    5.1 表達(dá)Bbsp：Spn43Ac提高球孢白僵菌毒力
    5.2 表達(dá)Bbsp：Spn43Ac不會(huì)影響菌株的萌發(fā)和生長
    5.3 表達(dá)Spn43Ac抑制昆蟲酚氧化酶活性
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄1 英文縮寫
附錄2 在讀期間獲得的成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]昆蟲酚氧化酶的研究進(jìn)展[J]. 劉麗萍,奚耕思,王芳,劉曉明.  生命科學(xué). 2013(04)
[2]基因工程改良在昆蟲病原真菌中的應(yīng)用[J]. 邊強(qiáng),王廣君,張澤華,高松,農(nóng)向群.  中國生物工程雜志. 2009(03)
[3]Toll-NF-κB信號(hào)途徑及其介導(dǎo)的功能[J]. 楊玉榮,佘銳萍,梁宏德.  細(xì)胞生物學(xué)雜志. 2007(04)
[4]球孢白僵菌絲氨酸蛋白酶基因CDEP-1在畢赤酵母中的表達(dá)[J]. 范艷華,張永軍,羅志兵,馮靜,方衛(wèi)國,裴炎.  菌物學(xué)報(bào). 2006(01)

博士論文
[1]球孢白僵菌孢壁蛋白相關(guān)的耐熱分子機(jī)理及其耐熱性狀的遺傳改良[D]. 應(yīng)盛華.浙江大學(xué) 2006
[2]球孢白僵菌降解寄主體壁的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的分子改良[D]. 范艷華.西南大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3557792