本文關(guān)鍵詞：茶園土壤中真菌反硝化作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：氧化亞氮(N20)是受《京都議定書》控制的地球大氣中最主要的溫室氣體之一,它對地球臭氧層造成嚴(yán)重破壞,進(jìn)而對人類及其他生物的生境安全構(gòu)成威脅。地球最主要的N20氣體的排放來自土壤,占到大氣N20氣體總排放量的65%。茶園土壤作為我國典型且特殊的農(nóng)業(yè)土壤類型,分布范圍和面積廣泛。因人們追求茶園的經(jīng)濟(jì)效益以及茶葉的品質(zhì)等,導(dǎo)致我國茶園對于氮素化肥的投入量巨大。長期以來,茶園土壤被施用過量的氮肥,造成茶園土壤嚴(yán)重酸化,并向大氣中排放大量的溫室氣體N2O。土壤排放的N20氣體與土壤中的微生物活動息息相關(guān),而在高度酸化的茶園土壤中,微生物的反硝化作用占據(jù)主要地位。長期以來,國內(nèi)外學(xué)者對于溫室氣體N20的研究多集中于水稻田等其他農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng),對于茶園的研究也多集中在茶葉品質(zhì)、茶園產(chǎn)量和管理等方面,對于茶園土壤N20氣體的排放等相關(guān)研究較少。本研究選用我國著名的綠茶產(chǎn)地——浙江省杭州市西湖區(qū)梅家塢植茶約100年的茶園土壤作為供試樣品。在實驗室條件下,首先系統(tǒng)的完成了土壤基本理化性質(zhì)、土壤N20排放量等方面的測定。同時,通過分別添加細(xì)菌抑制劑鏈霉素、真菌抑制劑放線菌酮,確定了100年茶園土壤中真菌反硝化作用對該土壤N20排放的貢獻(xiàn)比例。其次,運用研究土壤微生物傳統(tǒng)的分離方法,并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的先進(jìn)技術(shù)和分析手段,通過構(gòu)建土壤真菌18S ribosomaI RNA(18S rRNA)基因克隆文庫,對供試土壤樣品中的真菌多樣性等進(jìn)行分析研究,確定真菌反硝化作用對茶園土壤N20氣體排放的貢獻(xiàn)并分離得到一株反硝化真菌,命名為TF-1。最后,對真菌TF-1在不同生境條件下產(chǎn)生N20的能力進(jìn)行比較,確定所分離真菌進(jìn)行反硝化作用的最適條件。本研究主要結(jié)果如下：1.供試的100年茶園土壤為強酸性土壤,其pH僅為3.8,其N20釋放量在實驗室條件下測得高達(dá)37.80 ppm,是對照組某荒地土壤N20釋放量(1.43 ppm)的26.43倍。2.通過向100年茶園土壤中分別添加不同的抑制劑,明確了100年茶園土壤中真菌的反硝化作用是該土壤N20釋放的主要來源。鏈霉素作為抑制細(xì)菌的抑制劑,使得土壤N20氣體的排放量下降了29%,為7.69 mg/kg;而放線菌酮作為真菌的抑制劑,使得土壤N20氣體的排放下降了63%,僅為2.98mg/kg。3.實驗室條件下,從供試土壤中分離、篩選并純化得到一株耐強酸性、好氧反硝化真菌菌株,命名為TF-1,該菌株屬于青霉菌屬,子囊菌門。該真菌菌株僅能利用N03-作為氮源進(jìn)行反硝化作用產(chǎn)生N20氣體,且對于蘋果酸以及果糖、葡萄糖等單糖的利用效率高于蔗糖等較復(fù)雜的有機物。4.通過構(gòu)建18S rRNA基因土壤真菌克隆文庫,分析發(fā)現(xiàn)100年茶園土壤中真菌的多樣性較高,共分為22個OTU (Operational taxonomic unit),歸屬于五個真菌亞門,分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、毛霉亞門(Mucoromycotina)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)。本研究中所分離的真菌TF-1在供試的土壤中,有較高的相對豐度,在120個克隆子中有4條為該真菌序列,進(jìn)而證明該真菌對于100年茶園土壤N20氣體的釋放具有一定的貢獻(xiàn)值。
【關(guān)鍵詞】：N_2O氣體 真菌 反硝化作用 茶園土壤 N_2O排放 18S rRNA基因 溫室氣體
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S571.1;S154.3
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 第一章 緒論13-24
• 1.1 土壤N_2O排放的主要來源13-16
• 1.1.1 硝化作用14-15
• 1.1.2 反硝化作用15-16
• 1.2 茶園土壤的生物學(xué)特征16-17
• 1.3 土壤微生物研究方法17-21
• 1.3.1 傳統(tǒng)方法18-19
• 1.3.2 現(xiàn)代分子生物學(xué)方法19-21
• 1.3.3 生物化學(xué)方法21
• 1.4 研究背景、目的21-24
• 1.4.1 研究背景21-22
• 1.4.2 研究目的22-24
• 第二章 100年茶園土壤N_2O的釋放與真菌反硝化作用的貢獻(xiàn)研究24-37
• 2.1 前言24
• 2.2 材料與方法24-28
• 2.2.1 供試土壤24-25
• 2.2.2 實驗室條件下土壤釋放N_2O的測定25-28
• 2.3 結(jié)果與討論28-37
• 2.3.1 土壤基本理化性質(zhì)28-30
• 2.3.2 土壤微生物量30
• 2.3.3 土壤反硝化潛勢30-32
• 2.3.4 土壤微生物群落水平生理特征32-33
• 2.3.5 土壤N_2O釋放量33-34
• 2.3.6 土壤中真菌反硝化作用的貢獻(xiàn)34-37
• 第三章 100年茶園土壤反硝化真菌的分離、鑒定與產(chǎn)N_2O測定37-51
• 3.1 前言37-41
• 3.2 材料與方法41-45
• 3.2.1 供試土壤41
• 3.2.2 培養(yǎng)基與主要試劑的配制41-42
• 3.2.3 菌株的分離、篩選與純化42
• 3.2.4 真菌DNA的提取和18S rDNA的PCR擴增與測序42-44
• 3.2.5 真菌菌株反硝化能力測定44
• 3.2.6 真菌亞硝酸鹽還原酶基因nirK的PCR擴增44-45
• 3.3 結(jié)果45-51
• 3.3.1 菌株分離45
• 3.3.2 菌株形態(tài)觀察45-46
• 3.3.3 真菌18S rDNA PCR擴增46-47
• 3.3.4 測序結(jié)果47-48
• 3.3.5 分子鑒定菌株TF-148-49
• 3.3.6 菌株TF-1獲取GenBank序列號49
• 3.3.7 菌株TF-1反硝化能力49
• 3.3.8 功能基因nirK的PCR擴增49-51
• 第四章 100年茶園土壤真菌克隆文庫的構(gòu)建與反硝化真菌TF-1在文庫中的分析51-61
• 4.1 前言51-52
• 4.2 材料與方法52-56
• 4.2.1 供試土壤52
• 4.2.2 茶園土壤DNA提取與18S rDNA的PCR擴增52-53
• 4.2.3 PCR產(chǎn)物的回收53-54
• 4.2.4 土壤真菌18S rRNA基因克隆文庫構(gòu)建54-56
• 4.3 結(jié)果與分析56-61
• 4.3.1 土壤真菌18S rRNA基因克隆文庫測序結(jié)果分析56-59
• 4.3.2 反硝化真菌TF-1在克隆文庫中的分析59-61
• 第五章 培養(yǎng)條件對反硝化真菌TF-1產(chǎn)N_2O的影響與土壤接種實驗61-70
• 5.1 前言61-62
• 5.2 培養(yǎng)條件對反硝化真菌TF-1產(chǎn)N_2O的影響62-67
• 5.2.1 不同溫度條件下反硝化真菌TF-1產(chǎn)N_2O的比較62-63
• 5.2.2 不同pH條件下反硝化真菌TF-1產(chǎn)N_2O的比較63-65
• 5.2.3 不同碳源條件下反硝化真菌TF-1產(chǎn)N_2O的比較65-66
• 5.2.4 不同氮源條件下反硝化真菌TF-1產(chǎn)N_2O的比較66-67
• 5.3 反硝化真菌TF-1的土壤接種實驗67-68
• 5.3.1 100年茶園土壤的輻照滅菌67-68
• 5.3.2 土壤接種實驗68
• 5.4 結(jié)果68-70
• 5.4.1 反硝化真菌TF-1產(chǎn)生N_2O的最適培養(yǎng)條件68
• 5.4.2 100年茶園土壤中反硝化真菌TF-1產(chǎn)生N_2O的能力68-70
• 第六章 研究展望70-71
• 參考文獻(xiàn)71-84
• 碩士學(xué)位期間學(xué)術(shù)成果及獲獎情況84-85
• 致謝85-86

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