細胞自噬（Autophagy）是廣泛存在于真核生物中的一種溶酶體對細胞內(nèi)自身結(jié)構(gòu)進行吞噬和降解的現(xiàn)象。它既是細胞的一種自我保護機制,在一定條件下細胞自噬程序性死亡也是一種區(qū)別于細胞凋亡的Ⅱ型程序性細胞死亡（Programmed cell death, PCD）,因此具有重要的生物學功能。它參與生物個體的發(fā)育、疾病的發(fā)生、個體的衰老和細胞分化,同時也在生物體度過惡劣環(huán)境、抵御病原微生物等過程中發(fā)揮重要作用。Atg6 （autophagy-related-gene-6）是細胞自噬過程中的重要調(diào)節(jié)分子,具有自噬守門者之稱,在哺乳動物細胞中具有非常重要的生理功能。白噬相關蛋白Atg8定位于自噬體膜,在細胞發(fā)生自噬的過程中隨同自噬體一同進入液泡而被降解,因此常常作為研究細胞自噬的標記物。棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）,鱗翅目夜蛾科昆蟲的一種,是我國的重要害蟲之一,對農(nóng)作物造成了嚴重的危害。但目前有關Atg6對昆蟲細胞自噬的調(diào)節(jié)及棉鈴蟲Atg6基因?qū)ハx生長發(fā)育的影響研究還尚未見報。本研究通過RNA干擾技術(shù)使棉鈴蟲Atg6基因表達沉默,以探究該基因的沉默對蟲體生長發(fā)育的影響。首... 

【文章來源】：華中師范大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一部分 前言
    1.1 細胞自噬簡介
        1.1.1 細胞自噬的概念和分類
        1.1.2 細胞自噬的發(fā)生過程
        1.1.3 細胞自噬的特性
        1.1.4 細胞自噬與細胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)
    1.2 細胞自噬發(fā)生的分子機制
        1.2.1 自噬相關基因與相關蛋白
        1.2.2 自噬發(fā)生的分子機制
        1.2.3 自噬相關基因Atg6(Autophagy-related-gene-6)
    1.3 棉鈴蟲簡介
    1.4 本課題研究目的與意義
第二部分 實驗材料
    2.1 細胞系和細胞培養(yǎng)基
    2.2 質(zhì)粒和菌株
    2.3 實驗動物
        2.3.1 棉鈴蟲
        2.3.2 小鼠
    2.4 主要實驗藥品與試劑
    2.5 常用溶液及其配制
        2.5.1 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA所用溶液
        2.5.2 PBS(磷酸鹽緩沖液)
        2.5.3 5×TBE
        2.5.4 轉(zhuǎn)染用無血清Grace's
        2.5.5 蛋白質(zhì)凝膠電泳所用溶液
        2.5.6 蛋白免疫印跡(Western Blo)相關的溶液
        2.5.7 蛋白質(zhì)凝膠的配制
        2.5.8 卡那霉素(Kanamycin)與氨芐青霉素(Ampicillin)
    2.6 常用培養(yǎng)基的配制
        2.6.1 昆蟲Grace's Insect Cell Culture Medium
        2.6.2 液體LB培養(yǎng)基
        2.6.3 固體LB培養(yǎng)基
        2.6.4 棉鈴蟲人工飼料的配制
    2.7 主要實驗儀器與型號
    2.8 實驗中用到引物的名稱和及其引物序列
第三部分 實驗方法
    3.1 棉鈴蟲自噬相關基因Atg6干擾片段的克隆
        3.1.1 棉鈴蟲Atg6的基因序列分析
        3.1.2 棉鈴蟲Atg6基因RNA干擾片段選取
        3.1.3 干擾片段的擴增
    3.2 斜紋夜蛾細胞TH-Atg6干擾片段的克隆
        3.2.1 用clustalx軟件比對家蠶Atg6和棉鈴蟲細胞Ha-Atg6的ORF
        3.2.2 干擾片段的選取和目的基因的擴增
    3.3 棉鈴蟲四齡幼蟲中腸的解剖和凍存
    3.4 棉鈴蟲中腸總RNA的提取
    3.5 Ha-Atg6 cDNA的合成
        3.5.1 基因組DNA的去除
        3.5.2 cDNA的合成
    3.6 dsRNA注射棉鈴蟲
    3.7 實時熒光定量PCR反應體系
    3.8 棉鈴蟲生長繁殖指標統(tǒng)計
    3.9 dsRNA的合成
第四部分 實驗結(jié)果
    4.1 目的基因Atg6蛋白的表達和多克隆抗體的制備
    4.2 不同昆蟲細胞系中Atg6蛋白的差異表達
    4.3 無血清培養(yǎng)條件下Bme細胞中Atg6蛋白表達的變化
    4.4 斜紋夜蛾細胞TH-Atg6的RNA干擾和凋亡的關系研究
        4.4.1 斜紋夜蛾細胞TH-Atg6干擾片段的擴增和dsRNA的合成
        4.4.2 合成的TH-Atg6-dsRNA干擾效果的檢測
        4.4.3 TH-Atg6的RNA干擾和凋亡的關系
    4.5 斜紋夜蛾TH細胞和粉紋夜蛾TnH_5細胞中Atg6基因的干擾對細胞自噬的影響研究
        4.5.1 粉紋夜蛾細胞TnH_5-Atg6干擾片段的基因克隆及其dsRNA的合成
        4.5.2 TH-Atg6-dsRNA和TnH_5-Atg6-dsRNA干擾效率的檢測
        4.5.3 斜紋夜蛾細胞TH和粉紋夜蛾細胞TnH5中Atg6基因的干擾對細胞自噬的影響研究(western-blot方法)
        4.5.4 斜紋夜蛾細胞TH-Atg6干擾48h后Atg8轉(zhuǎn)錄子的相對定量結(jié)果
    4.6 斜紋夜蛾細胞TH-Atg6的超表達對細胞自噬的影響
        4.6.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的檢測
        4.6.2 斜紋夜蛾細胞TH-Atg6的超表達對細胞自噬的影響探究
    4.7 棉鈴蟲Atg6基因進化樹
    4.8 棉鈴蟲自噬相關基因Atg6和對照GFP基因干擾片斷的PCR擴增以及dsRNA的合成
    4.9 棉鈴蟲Atg6-dsRNA沉默了Atg6基因的表達
        4.9.1 熒光定量PCR產(chǎn)物特異性分析
        4.9.2 棉鈴蟲四齡幼蟲中腸組織中Atg6轉(zhuǎn)錄子的相對定量檢測
    4.10 棉鈴蟲Atg6基因沉默對其生長發(fā)育的影響
        4.10.1 Ha-Atg6基因沉默對棉鈴蟲體重無顯著影響
        4.10.2 Atg6基因的沉默使棉鈴蟲產(chǎn)卵量下降
        4.10.3 Atg6基因沉默使棉鈴蟲孵化率減小
    4.11 qRT-PCR方法對棉鈴蟲Atg6干擾最適計量的探究
第五部分 討論
    5.1 Atg6介導的昆蟲細胞自噬研究
    5.2 Atg6對棉鈴蟲繁殖的影響研究
        5.2.1 棉鈴蟲Atg6基因dsRNA注射蟲體降低蟲體內(nèi)該基因mRNA水平
        5.2.2 棉鈴蟲Atg6基因表達沉默使蟲體繁殖能力下降
參考文獻
碩士期間合作發(fā)表論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雷帕霉素對二種鱗翅目昆蟲細胞自噬和凋亡的影響[J]. 李佳芮,鄧玉杰,張許平,付濤,馬源,郭建軍,劉凱于.  昆蟲知識. 2009(03)
[2]昆蟲細胞程序性死亡的研究進展[J]. 劉凱于,鄧玉杰,張許平,彭建新,李毅,洪華珠.  昆蟲學報. 2008(06)



本文編號：3223084