發(fā)布時(shí)間：2020-10-30 01:25

　　 瓜類細(xì)菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB),是世界范圍內(nèi)的細(xì)菌性檢疫病害,通過種傳嚴(yán)重為害如西瓜、甜瓜等葫蘆科作物,在世界各國(guó)的西、甜瓜產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。BFB的病原菌為西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli),革蘭氏染色陰性,單根極生鞭毛,最適生長(zhǎng)溫度24~28℃,能夠通過III型分泌系統(tǒng)(TypeⅢsecretion system,T3SS)將效應(yīng)子(effector)直接注入到宿主細(xì)胞體內(nèi)。目前,仍沒有針對(duì)BFB的商品化的抗病品種。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控對(duì)于基因的表達(dá)、蛋白的正常裝配、生命活動(dòng)的維持具有重要意義。Hfq為RNA伴侶蛋白,能夠同小型非編碼RNA(small non-coding RNA,sRNA)一起對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后水平做出調(diào)控,促進(jìn)或抑制靶標(biāo)mRNA的翻譯。而MiaA是tRNA異戊烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶,能夠在促進(jìn)翻譯保真度方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,翻譯階段為了合成有效的多肽,需要額外的核糖體相關(guān)蛋白,HflX便是其中之一。編碼HflX的基因位于hfq基因下游,能夠編碼GTP結(jié)合蛋白,利用GTP的水解可以驅(qū)動(dòng)其他相關(guān)蛋白的功能循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)hfq、miaA、hflX基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,了解了其在西瓜噬酸菌中的基因信息,為了研究基因的功能,通過三親及同源重組交換構(gòu)建了miaA、hflX基因的缺失突變菌株,并進(jìn)行了基因的回補(bǔ),獲得了互補(bǔ)菌株,同野生菌株Aac5進(jìn)行了各項(xiàng)表型的測(cè)定,并利用qRT-PCR測(cè)定了hfq、miaA、hflX三者之間可能存在的調(diào)控關(guān)系。此外,利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及構(gòu)建hfq過表達(dá)菌株,檢測(cè)了西瓜噬酸菌中可能存在的Hfq依賴性sRNA,對(duì)其在壓力環(huán)境下的表達(dá)量測(cè)定之后,選取候選sRNA NC-27在基因組中對(duì)其進(jìn)行了敲除及回補(bǔ),研究了其在西瓜噬酸菌中的功能并對(duì)其靶標(biāo)mRNA做出了預(yù)測(cè)。結(jié)果如下:(1)通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),西瓜噬酸菌中hfq基因所編碼的Hfq蛋白含83個(gè)氨基酸,無特殊結(jié)構(gòu)域,能夠作為RNA伴侶蛋白行使功能;MiaA蛋白由350個(gè)氨基酸組成,具有兩個(gè)低復(fù)雜度域和一個(gè)IPPT結(jié)構(gòu)域,它可以催化反密碼子附近腺苷的修飾;HflX由390個(gè)氨基酸組成,具有兩個(gè)GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Feo_B結(jié)構(gòu)域。通過蛋白互作關(guān)系的預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn),Hfq、MiaA、HflX三者可能存在互作關(guān)系。(2)miaA、hflX的缺失均降低了西瓜噬酸菌對(duì)寄主的致病能力。miaA的缺失,使得西瓜噬酸菌Aac5的三型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵基因hrpX顯著下調(diào),致病力及生物膜形成能力顯著下降,褐色素分泌增多,但未影響其引起煙草過敏性反應(yīng)的能力。而hflX基因的缺失,同樣未對(duì)西瓜噬酸菌Aac5菌株引起煙草過敏性反應(yīng)的能力產(chǎn)生影響。盡管表現(xiàn)出了更強(qiáng)的生物膜形成能力,但是運(yùn)動(dòng)能力卻顯著下降,同時(shí),三型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵基因hrpG、hrpE顯著下調(diào),其致病能力也顯著下降。(3)miaA、hflX同hfq之間存在調(diào)控關(guān)系。經(jīng)qRT-PCR測(cè)定后發(fā)現(xiàn),hfq基因受到hflX、miaA基因正向調(diào)控,hflX基因受到miaA基因正向調(diào)控,miaA基因受到hflX基因負(fù)向調(diào)控。(4)在西瓜噬酸菌中預(yù)測(cè)到了31個(gè)sRNA,其中6個(gè)候選sRNA的穩(wěn)定性依賴于Hfq蛋白。使用SIPHT在西瓜噬酸菌AAC00-1中預(yù)測(cè)到了31個(gè)潛在的sRNA,使用hfq過表達(dá)菌株的cDNA進(jìn)行real-time PCR后發(fā)現(xiàn),其中有6個(gè)sRNA的表達(dá)量顯著上調(diào),即這些sRNA的穩(wěn)定性依賴于Hfq蛋白。在不同壓力環(huán)境下,候選sRNA的表達(dá)量有所不同。(5)候選sRNA NC-27的缺失,增加了西瓜噬酸菌Aac5的致病能力。NC-27的缺失,增加了hrpG mRNA積累,致使T3SS蛋白HrpG增多,而作為hrpX的上游調(diào)控因子,其增多也導(dǎo)致了hrpX mRNA乃至HrpX的上調(diào)表達(dá),同時(shí),裝置蛋白HrcJ也大量增加,使得其致病力增強(qiáng)。(6)使用Target RNA2在西瓜噬酸菌中共預(yù)測(cè)到了候選sRNA NC-27的29個(gè)靶mRNA,通過對(duì)NC-27的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn),其在3’端具有一段富含尿嘧啶(U)的序列,能夠同Hfq蛋白內(nèi)圈氨基酸接觸,而同候選靶mRNA的結(jié)合位點(diǎn)主要位于102~117核酸之間。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S432.42
【部分圖文】：

文 圖 1.1 瓜類細(xì)菌性果斑病的典型癥狀[10,15~16]Figure 1.1 Typical symptoms of BFB[10,15~16]酸菌為西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）[15~16]，革蘭氏染光，嚴(yán)格好氧，單根極生鞭毛（圖 1.2A），均大小約為 0.5 μm×1.7 μm[5]，于 KB 平板上呈圓形

林省和黑龍江省的西瓜和甜瓜發(fā)病率達(dá)15%，每年都造成十分巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BFB作為一種檢疫性細(xì)菌性病害，主要通過種子傳播，在西瓜、甜瓜等植株的整個(gè)生長(zhǎng)期均能發(fā)生侵染，染病初期會(huì)在子葉的背面形成水浸狀病斑（圖1.1），病斑最初呈離散分布，后沿葉脈逐漸擴(kuò)展，連接成片，通過莖部到達(dá)真葉的組織，造成整個(gè)幼苗的壞死。在染病后期，水浸斑逐漸變干，并形成狹長(zhǎng)，暗紅色的枯斑。果實(shí)染病的典型特點(diǎn)是在瓜類果實(shí)表皮上形成零星的病斑，隨后蔓延至整個(gè)果皮表面；同時(shí)，也可以向內(nèi)侵入果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)造成果肉腐爛。在香瓜葉片上，病斑由棕褐色變成紅棕色，并從葉片邊緣擴(kuò)展呈V字形病斑。南瓜上除出現(xiàn)以上癥狀外，也可能出現(xiàn)大面積的黃萎。在整個(gè)循環(huán)期中，帶菌種子是最主要的初侵染源，由于農(nóng)耕和農(nóng)播的進(jìn)行，帶菌種子進(jìn)入土壤，6~10 d發(fā)芽后于苗期便可顯癥。此外

RNA 分子伴侶蛋白，具有六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在原核針對(duì)特定的靶基因，能夠?qū)Π谢虻霓D(zhuǎn)錄后或是基 sRNA 的調(diào)控作用中，尤其是在反式調(diào)控（Tran，是目前已知的最為重要的 sRNA 結(jié)合蛋白之一。完全清楚，但是已有的數(shù)據(jù)表明，Hfq 至少在翻譯的作用[67]。后、蛋白翻譯前，Hfq 蛋白同 sRNA 一起對(duì)于靶式: 靶標(biāo) mRNA 原本具備正常翻譯的條件，但當(dāng) ，能夠占據(jù)核糖體上與 mRNA 結(jié)合的位點(diǎn)（RimRNA 無法正常結(jié)合于核糖體，阻礙其翻譯的進(jìn)行 會(huì)在 5'非翻譯區(qū)自我互補(bǔ)配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，阻。Hfq 的正向調(diào)控方式是先與調(diào)控靶標(biāo) mRNA 的能夠打開靶標(biāo) 5'非翻譯區(qū)上的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使得靶核糖體，促使靶標(biāo)翻譯的正常進(jìn)行（圖 1.3B）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2861761