發(fā)布時間：2020-10-24 03:33

　　 植物寄生性線蟲是引起植物病害的主要病原物之一,其寄主范圍廣、為害嚴重,每年對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失達1500多億美元。目前防治植物寄生線蟲仍然以化學防治為主,但其毒性較大、污染環(huán)境,對人畜健康存在潛在威脅。隨著高毒農(nóng)藥在我國的禁用,亟需開發(fā)綠色環(huán)保、安全的生防菌來防治植物寄生線蟲。本研究采集湖南省不同類型土壤,并對土壤中的細菌進行了分離、篩選,獲得了一株對馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)和水稻擬禾本科根結(jié)線蟲(Meloidogyne graminicola)都具有顯著抑制活性的菌株D45。利用形態(tài)學、生理生化和分子生物學技術(shù)對其進行鑒定,并對其進行發(fā)酵條件優(yōu)化和對發(fā)酵產(chǎn)生的殺線蟲物質(zhì)進行了初步分析。主要研究和結(jié)果如下:1、采用土壤稀釋法,從湖南省張家界、大圍山等土壤較為肥沃、微生物較為豐富且無人工污染的地區(qū)采集不同類型的土壤樣品中分離得到186株細菌。初篩以馬鈴薯腐爛莖線蟲為靶標線蟲,采用直接觸殺法對土壤分離細菌進行篩選,初篩獲得8株具有較高殺線蟲活性的菌株。以擬禾本科根結(jié)線蟲二齡幼蟲為靶標線蟲進行復篩,發(fā)現(xiàn)D45、D54菌株對擬禾本科根結(jié)線蟲二齡幼蟲的活性較高。其中D45菌株發(fā)酵液的殺蟲活性最高,其發(fā)酵液上清5倍稀釋液處理24 h、48 h后,馬鈴薯腐爛莖線蟲和擬禾本科根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率分別為69.8%、72.1%和60.9%、70.4%。2、盆栽試驗結(jié)果表明,菌株D45發(fā)酵液稀釋2倍、5倍后對水稻擬禾本科根結(jié)線蟲的防治效果分別為79.1%和64.8%。菌株D54發(fā)酵液對水稻擬禾本科根結(jié)線蟲的防治效果相對D45較差,其2倍和5倍稀釋液的防治效果分別為66%和45.7%%。田間試驗結(jié)果表明,菌株D45發(fā)酵液稀釋2倍、5倍后對水稻擬禾本科根結(jié)線蟲的防治效果分別為56.3%和53.0%;菌株D54發(fā)酵液稀釋2倍、5倍后對水稻擬禾本科根結(jié)線蟲的防治效果分別為52.0%和44.3%。3、通過顯微形態(tài)觀察,生理生化測定結(jié)合16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定菌株D45為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、D54為阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)。4、采用單因素法對活性菌株D45發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,確定其最佳氮碳源的配方為:麥芽糖30g/L、蛋白胨4g/L;最佳發(fā)酵條件為:溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r/min、pH值7.5。5、代謝產(chǎn)物毒力測試結(jié)果表明,菌株D45發(fā)酵液對秀麗隱桿線蟲具有較高的殺蟲活性,并可抑制其運動和擴散行為;菌株D45發(fā)酵液揮發(fā)物對馬鈴薯腐爛莖線蟲有一定的殺線活性。推測D45菌株代謝活性物質(zhì)中可能存在作用于線蟲運動神經(jīng)的揮發(fā)性小分子化合物。
【學位單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S476.1
【部分圖文】：

1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行 16SrDNA 的 PCR 擴增。PCR 件:95℃預變性 2.5min，94℃變性 30S，55℃復變性 1min，72℃延伸 1min，35 個72℃延伸 10min。擴增產(chǎn)物純化后連接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆載體中，篩選隆送上海生工生物工程有限公司測序。將菌株的 16S rDNA 的測序序列與 GenBank 中已登錄的序列進行 BLAST 選取序列相似性較高的典型菌株的基因序列作為參比對象，應用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（穩(wěn)定性檢測重復取樣 1000 次），進行聚類分4.3 結(jié)果與分析4.3.1 芽孢桿菌 D45 的鑒定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形態(tài)觀察鑒定在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 25℃±1℃培養(yǎng) 24h 的菌落形態(tài)不規(guī)則，邊緣褶皺糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黃色（圖 4-1）。在光學顯微鏡下觀察，D株菌體呈桿狀、端圓（圖 4-2），鞭毛周身。

1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行 16SrDNA 的 PCR 擴增。PCR 件:95℃預變性 2.5min，94℃變性 30S，55℃復變性 1min，72℃延伸 1min，35 個72℃延伸 10min。擴增產(chǎn)物純化后連接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆載體中，篩選隆送上海生工生物工程有限公司測序。將菌株的 16S rDNA 的測序序列與 GenBank 中已登錄的序列進行 BLAST 選取序列相似性較高的典型菌株的基因序列作為參比對象，應用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（穩(wěn)定性檢測重復取樣 1000 次），進行聚類分4.3 結(jié)果與分析4.3.1 芽孢桿菌 D45 的鑒定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形態(tài)觀察鑒定在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 25℃±1℃培養(yǎng) 24h 的菌落形態(tài)不規(guī)則，邊緣褶皺糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黃色（圖 4-1）。在光學顯微鏡下觀察，D株菌體呈桿狀、端圓（圖 4-2），鞭毛周身。

生防細菌 D45 的生理生化特性表現(xiàn)為革蘭氏反應為陽性，可水解淀粉，能與硝酸鹽產(chǎn)生還原反應，甲基紅試驗為陰性反應，能利用過氧化氫酶，不產(chǎn)硫化氫，具備分解明膠的能力，乙酰甲基甲醇試驗為陽性。其特征符合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[58]中關(guān)于芽孢桿菌的描述（表 4-1）。表 4-1 菌株 D45 的部分生理生化特性Table 4-1 Physiological and biochemical characteristics of strain D45測試項目Items tested特性CharacteristicH2S 試驗 -甲基紅試驗 Methyl-red +明膠液化 Gelatin liquefaction +硝酸鹽還原 Nitrate reduction +淀粉水解 Starch hydrolysis +糖氧化發(fā)酵測定 Sugar fermentation -接觸酶 Catalase +乙酰甲基甲醇 Acetyl methyl carbinol +革蘭氏染色 Gram staining G+
【參考文獻】

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本文編號：2853960