甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner是一種間歇性暴發(fā)的多食性害蟲,自20世紀(jì)80年代中后期以來,在棉田的危害越來越嚴(yán)重,主要依靠化學(xué)農(nóng)藥對(duì)其進(jìn)行防治。辛硫磷(phoxim)是一種高效、廣譜的有機(jī)磷殺蟲劑,廣泛用于防治咀嚼式口器害蟲;Cry1Ca是一種對(duì)甜菜夜蛾具有高毒力的微生物源殺蟲蛋白,但使用單一藥劑易導(dǎo)致甜菜夜蛾產(chǎn)生抗藥性。農(nóng)藥復(fù)配具有擴(kuò)大防治譜、協(xié)同增效及延緩害蟲抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。因此,本試驗(yàn)旨在通過研究辛硫磷(LC_(30))與Cry1Ca(LC_(30))復(fù)配(簡稱混劑)對(duì)甜菜夜蛾的毒力變化,明確混劑對(duì)甜菜夜蛾毒力的協(xié)同作用,探索混劑協(xié)同增效對(duì)甜菜夜蛾解毒酶、抗性相關(guān)基因及體內(nèi)共生微生物的影響,為揭示和闡明辛硫磷與Cry1Ca的增效機(jī)理及甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下所示:1、利用表面污染法研究了辛硫磷與Cry1Ca的亞致死劑量對(duì)甜菜夜蛾的毒力作用。與空白處理相比,取食混劑的甜菜夜蛾2齡幼蟲在3 d、5 d、7 d的死亡率分別為52.73%、93.13%、95.87%,分別比單獨(dú)取食辛硫磷和Cry1Ca試蟲的死亡率提高了22.06%、48.46%、50.87%和52.73%、75.40%、78.14%,故混劑毒力顯著高于兩個(gè)單劑;取食混劑的幼蟲歷期延長至15.6 d,分別比取食辛硫磷和Cry1Ca的幼蟲歷期延長了2.1 d和4.7 d。因此,混劑對(duì)防治甜菜夜蛾的協(xié)同增效作用顯著。2、混劑對(duì)甜菜夜蛾堿性磷酸酯酶表達(dá)水平具有較大的影響。試驗(yàn)通過RACE技術(shù)獲得甜菜夜蛾可溶性堿性磷酸酯酶基因SesALP1、SesALP2的全長序列,且發(fā)現(xiàn)SesALP1、SesALP2均在幼蟲中腸組織呈現(xiàn)高表達(dá)水平;利用qPCR分析混劑對(duì)Se ALP mRNA表達(dá)水平的影響,結(jié)果表明SesALP1和SesALP2的表達(dá)水平在處理32 h后分別表現(xiàn)為上調(diào)和下調(diào);在處理0 h~32 h,SemALP1的表達(dá)水平隨取食時(shí)間推移呈先升高后降低的趨勢(shì),SemALP2~SemALP5的表達(dá)水平呈先下降后上升的趨勢(shì)。3、混劑對(duì)甜菜夜蛾解毒酶及抗性相關(guān)基因具有較大的影響。甜菜夜蛾取食辛硫磷、Cry1Ca及混劑8 h后,試蟲CAT活力顯著升高,分別是空白處理的37.74倍、1.23倍、43.65倍,混劑處理組CAT活力顯著高于單劑處理;在處理24 h后,藥劑處理試蟲體內(nèi)AChE活性均顯著低于空白處理,但各處理間差異不顯著;在處理8 h和24 h后,Cry1Ca處理組CarE活力分別是空白處理的4.97和1.42倍,辛硫磷和混劑對(duì)CarE活力的抑制率分別為37.72%、65.35%和45.27%、52.36%,故Cry1Ca對(duì)CarE活性具有誘導(dǎo)作用,辛硫磷、混劑對(duì)CarE活性均具有抑制作用。通過qPCR進(jìn)一步對(duì)試蟲抗性相關(guān)基因P450和ABCC在0 h~24 h表達(dá)水平的變化進(jìn)行分析,結(jié)果表明ABCC3、ABCC4、ABCC12的表達(dá)水平先降低后升高,而CYP4L7、CYP4M15、CYP4S9、CYP6AB31、CYP6AE47、CYP6AE97、CYP9A9、CYP9A10、ABCC1、ABCC2、ABCC5、ABCC6表達(dá)水平先上升后降低。4、混劑對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)共生微生物的多樣性具有較大影響。運(yùn)用16S rDNA宏基因組測(cè)序技術(shù),檢測(cè)辛硫磷與Cry1Ca的協(xié)同增效對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)共微生物多樣性的影響。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得到用于物種分類的OTUs數(shù)目為4318,RS1(辛硫磷+Cry1Ca)、RS2(辛硫磷)、RS3(Cry1Ca)、RS4(空白對(duì)照)4組處理樣品的稀釋曲線均逐漸趨于平緩,可基本反映處理試蟲體內(nèi)微生物的群落組成。OTUs聚類結(jié)果顯示,4組樣品微生物群落豐度的大小為RS2RS3RS1RS4;由Beta多樣性指數(shù)組間差異分析可知,4組樣品微生物群落的多樣性順序?yàn)镽S2RS3RS4RS1,故混劑顯著降低了試蟲體內(nèi)微生物的多樣性;4種處理在門水平上和綱水平上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群分別有4種(厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門)和6種(梭菌綱、芽孢菌綱、α變形菌綱、γ變形菌綱、放線菌綱、擬桿菌綱)。從屬水平分析可知,辛硫磷與Cry1Ca復(fù)配顯著提高了紅球菌屬的豐度、顯著降低了乳酸菌屬和不動(dòng)菌屬的豐度。綜上所述,辛硫磷與Cry1Ca二者混用對(duì)甜菜夜蛾的毒力具有明顯的增效作用,并且藥劑的協(xié)同作用對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)部分保護(hù)酶活力、解毒酶活力、抗性基因表達(dá)水平以及體內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,導(dǎo)致其對(duì)藥劑的敏感性發(fā)生改變。本項(xiàng)研究初步明確了辛硫磷與Cry1Ca對(duì)甜菜夜蛾的協(xié)同作用及增效機(jī)理,為甜菜夜蛾的抗藥性治理和科學(xué)防治提供理論指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S433.4
【部分圖文】：

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 辛硫磷與 Cry1Ca 的混劑對(duì)甜菜夜蛾的協(xié)同增效作用2.4 結(jié)果與分析2.4.1 辛硫磷、Cry1Ca 對(duì)甜菜夜蛾 2 齡幼蟲的毒力由圖 2-1 可知，在辛硫磷單劑（A）的作用下，當(dāng)濃度為 368.42 ng/cm2時(shí)，甜菜夜蛾幼蟲的死亡率與對(duì)照處理相比未達(dá)到顯著差異；當(dāng)處理濃度≥1247.37 ng/cm2時(shí)，各藥劑處理間試蟲死亡率無顯著差異。在 Cry1Ca 單劑（B）作用下，當(dāng)濃度為 0.99 ng/cm2時(shí)，幼蟲死亡率與對(duì)照處理無顯著差異；當(dāng)處理濃度≥157.89 ng/cm2時(shí)，各藥劑處理間幼蟲死亡率無顯著差異。

表 2-4 甜菜夜蛾 2 齡幼蟲取食 Cry1Ca 7 d 后的體重抑制率Table 2-4 Inhibition rate of S. exigua larvae weight after treated 7 d with Cry1Ca劑量(ng/cm2)Concentration0 9.87 19.74 39.47 78.95 157.89 315.78體重抑制率（%）Inhibition rate ofweight0.00 ±0.00 d57.13 ±0.07 c78.24 ±1.42 b81.34 ±1.53 b94.26 ±0.47 a94.76 ±0.95 a96.59 ±0.45 a注：數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示數(shù)據(jù)間在 0.05 水平上差異顯著（P﹤0.05）。下表同。Note: Data in the same row followed by different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level.2.4.2 混劑對(duì)甜菜夜蛾 2 齡幼蟲的毒力取食亞致死劑量辛硫磷與 Cry1Ca 的混劑的甜菜夜蛾 2 齡幼蟲，在藥后 3、5、7 d 試蟲的際死亡率分別為 52.73%、93.13%和 95.87%，遠(yuǎn)高于混劑處理藥后 3 d（30.67%）、5 d（54.40%和 7 d（54.69%）的甜菜夜蛾期望死亡率（圖 2-2A）。比較甜菜夜蛾取食亞致死劑量混合藥劑后 3、5、7 d 的實(shí)際死亡率和期望死亡率，所得卡方值分別為 15.87、27.57 和 33.03，均大于 3.8故辛硫磷與 Cry1Ca 具有協(xié)同增效作用。試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量的混合藥劑顯著抑制存活菜夜蛾幼蟲體重增長（圖 2-2B），藥后 3 d 混合物對(duì)甜菜夜蛾幼蟲的抑制效果顯著高于 Cry1Ca 辛硫磷單劑；藥后 5 d 混合藥劑對(duì)存活幼蟲的抑制作用顯著高于 Cry1Ca，但與辛硫磷無顯著差異

21圖 3-2 甜菜夜蛾 SesALP1、SesALP2 氨基酸序列的多重序列比對(duì)結(jié)果右側(cè)的數(shù)字表示蛋白質(zhì)序列上氨基酸的位置，信號(hào)肽位置用實(shí)線標(biāo)出，堿性磷酸酶激活序列用實(shí)線方框標(biāo)出，堿性磷酸酶激活位點(diǎn)用下方小黑三角表示，底物結(jié)合位點(diǎn)用上方小實(shí)心圓點(diǎn)表示。Fig.3-2 Protein sequence alignment of SesALP1, SesALP2 from S. exigua larvae.Numbers on the right side of the alignment indicate the position of residues in the protien.The predicted N-terminal signalpeptide sequence are lined.The predicted phosphatase domains are marked in box. The predicted phosphatase active sitesare indicated by black triangle.Substrate binding sites are marked by dot above.
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2841451