【摘要】：大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是一種寄主廣泛的土傳性植物病原真菌,可引發(fā)植物黃萎病。在大麗輪枝菌侵染植物過程中,會(huì)分泌大量的細(xì)胞壁降解酶,破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)侵染。同時(shí),植物可以特異性識(shí)別植物細(xì)胞壁降解酶,激活自身的免疫反應(yīng),抵御病原菌的入侵。對(duì)大麗輪枝菌細(xì)胞壁降解酶的深入研究,有助于了解其致病性和誘導(dǎo)植物抗病性的機(jī)理,從而為黃萎病防治提供見解與思路。本研究從大麗輪枝菌中分離鑒定出一個(gè)果膠裂解酶VdPEL1,可以作為毒力因子,在大麗輪枝菌致病性中發(fā)揮作用,同時(shí)VdPEL1能夠誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng),增強(qiáng)植物抗病性。本研究中獲得以下結(jié)果:1.VdPEL1在大麗輪枝菌侵染植物過程中發(fā)揮作用通過參考V.dahliae Vd991菌株侵染棉花早期的分泌組學(xué)數(shù)據(jù),鑒定到一個(gè)分泌的果膠裂解酶,命名為VdPEL1。qPCR數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,在大麗輪枝菌Vd991侵染棉花和煙草植株的早期,VdPEL1基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá),說(shuō)明VdPEL1可能參與了侵染過程。通過基因敲除獲得了兩個(gè)大麗輪枝菌VdPEL1基因缺失突變體菌株?VdPEL1-1和?VdPEL1-2。與野生型菌株相比,?VdPEL1-1和?VdPEL1-2表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)表型。致病性檢測(cè)結(jié)果顯示,缺失突變體菌株相比于野生型菌株,其致病力顯著下降,而VdPEL1基因缺失突變體回補(bǔ)菌株EC-1和EC-2則恢復(fù)了與野生型菌株相似的致病性。2.VdPEL1蛋白真核表達(dá)與酶活性檢測(cè)成功構(gòu)建VdPEL1真核表達(dá)載體pPICZaA-VdPEL1,轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞,通過誘導(dǎo)表達(dá)和純化后得到了高純度和濃度的重組蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示VdPEL1重組蛋白大小為30 kDa。純化后的VdPEL1蛋白具有果膠裂解酶活性,且其酶活性受溫度,Ca~(2+)濃度和pH影響。3.VdPEL1誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死反應(yīng)VdPEL1可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生細(xì)胞壞死反應(yīng),其最低作用濃度為0.3μM。同時(shí)VdPEL1可以誘導(dǎo)多種植物的細(xì)胞壞死反應(yīng),包括:番茄,大豆和棉花。瞬時(shí)表達(dá)VdPEL1也可以誘導(dǎo)植物的細(xì)胞壞死反應(yīng),且VdPEL1瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死的能力需要其信號(hào)肽。VdPEL1誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死反應(yīng)的能力依賴其果膠裂解酶活性,VdPEL1~(REC)(無(wú)果膠裂解酶活性的VdPEL1)不能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生細(xì)胞壞死反應(yīng)。4.VdPEL1誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性VdPEL1誘導(dǎo)植物產(chǎn)生PTI反應(yīng),包括:ROS和胼胝質(zhì)的積累,電解質(zhì)滲漏,以及植物防御相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。此外,VdPEL1可以增強(qiáng)植物的抗病性,煙草葉片注射VdPEL1后,對(duì)灰霉菌和大麗輪枝菌抗性顯著增強(qiáng),VdPEL1處理過的棉花植株相比于PEVC和VdPEL1~(REC)處理過的棉花植株,接種大麗輪枝菌后,顯著減輕了黃萎病癥狀。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.44
【圖文】：

國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 的抗逆能力，在溫度范圍（-30-80℃）內(nèi)均可以存活[13]。黃萎病作為一種單循環(huán)病害，感病植株殘?bào)w及土壤中存活的微菌核是第二年黃萎病發(fā)生的侵染源（圖 1.1）[14,15]。微菌核在適宜的萌發(fā)溫度條件（最適溫度： 25-30℃）下萌發(fā)，萌的微菌核從植物根毛或根尖部位侵入植物體內(nèi)。當(dāng)微菌核形成芽管或菌絲結(jié)構(gòu)時(shí)，它可以延植物的維管束組織中并產(chǎn)生大量分生孢子。分生孢子借助植物的蒸騰作用，作為向植物地上運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力，從根部擴(kuò)展至植物的莖部和葉片，最終導(dǎo)致整株植物感病。感病植物的葉片逐化，脫落，植物枯萎，果實(shí)脫落，導(dǎo)致植物產(chǎn)量和質(zhì)量下降。 隨著感病植物逐漸死亡，寄生麗輪枝菌進(jìn)入腐生階段并在植物殘?bào)w中產(chǎn)生新的微菌核。而這些新的微菌核從植物殘?bào)w進(jìn)入中休眠存活，作為第二年黃萎病的初始侵染源，進(jìn)入第二個(gè)病害循環(huán)。

圖 1.2 植物免疫系統(tǒng)的 Zigzag 模型Figure 1.2 A zigzag model illustrates the quantitative output of the plant immune system. PAMPs 或 MAMPs 的信號(hào)直接傳至細(xì)胞內(nèi)，因此需要與 RLKs 形成復(fù)合體域?qū)崿F(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) [56, 57]。圖 1.3 集中展示了目前被廣泛研究的 PAMPs2 作為第一個(gè)被鑒定的植物模式識(shí)別受體（RLK），可以特異性地識(shí)別 fl2 基因的擬南芥中，flg22 不能被正確的識(shí)別以及激活擬南芥的免疫反應(yīng)。 的受體，EF-TU 處理后的擬南芥 EFR 突變體植株不能產(chǎn)生 PTI 反應(yīng)[46]。eceptor kinase 1）和 SOBIR1（SUPPRESSOR OF BIR1-1）是目前研究最為K1 作為植物免疫系統(tǒng)的中心調(diào)控者，與其他 PRRs 共同參與植物對(duì) PAM例如 FLS2 和 FER 接收到 flg22 和 ET-TU 信號(hào)后，與 BAK1 形成復(fù)合體，[59]。擬南芥 RLP30 可以識(shí)別核盤菌 PAMPSCFE1，誘導(dǎo)乙烯的大量產(chǎn)生0]。番茄 RLP SlEix2 直接與木聚糖酶（EIX）互作，參與植物的抗病過程少胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域，往往需要與 SOBIR1 形成復(fù)合體，完成對(duì) PAMP一些 PAMPs 的過敏性壞死反應(yīng)也依賴于 BAK1 和 SOBIR1，比如疫霉屬灰霉菌 PAMPs BcSpl1, Bcxyl1 和 BcXYG1，大麗輪枝菌 PAMPs VdEG1[29, 51, 52, 64, 65]。

圖 1.3 PRRs 和對(duì)應(yīng)的 PAMPsFigure 1.3 Representative PRRs and their ligands物的 R 蛋白可以直接與 effectors 結(jié)合，例如稻瘟菌效應(yīng)子 AvrPi-ta 可以直接與水稻 R 蛋白 互作，激活水稻 ETI 反應(yīng)[67]。R 蛋白除了可以直接和 effector 互作外，R 蛋白也可以間接識(shí)ffector。例如丁香假單胞桿菌 efferctor AvrPphB 可以與植物 PBS1 蛋白酶直接互作，AvrPphB PBS1 的產(chǎn)物可被 R 蛋白 RPS5 識(shí)別，激活植物 ETI 反應(yīng)[68]。相比 PTI 反應(yīng)，ETI 反應(yīng)更快烈，往往伴隨著過敏性細(xì)胞壞死反應(yīng)（hypersensitive response，HR）的產(chǎn)生[40]。.2.3 植物的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性植物的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性主要包括系統(tǒng)獲得抗病性（systemic acquired resistance, SAR）和誘統(tǒng)抗病性（induced systemic resistance, ISR） [69, 70]。系統(tǒng)獲得抗病性是指植物感知病原菌擊，免疫信號(hào)由初始侵染點(diǎn)迅速傳遞到至整株植株，SAR 過程往往伴隨著一系列的免疫事件括 HR 反應(yīng)、ROS 和胼胝質(zhì)的積累、以及植物防御相關(guān)基因的表達(dá)等。誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性是指物根際周圍的微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生的系統(tǒng)抗病性。根據(jù)報(bào)道，假單胞菌，芽孢桿菌和木霉菌等均導(dǎo) ISR。比于 ISR，SAR 誘發(fā)產(chǎn)生的抗病性更為持久，對(duì)多種病原微生物的抗性作用顯著[71

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