【摘要】：青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種對農(nóng)作物危害很大的土傳性植物病原細(xì)菌,目前傳統(tǒng)防治方法防效不理想。近年來,生物防治因其具有對環(huán)境友好、對人畜安全的特性成為植物病害防治研究的熱點(diǎn)。為了篩選出對番茄青枯病具有較好防效的生防菌,我們在上海地區(qū)的番茄青枯病自然衰退土壤中采集土樣,通過拮抗試驗(yàn)分離篩選到一株對該病原菌有很強(qiáng)抑制能力的菌株SN15-2,我們對菌株SN15-2進(jìn)行了鑒定,并對其抗生素產(chǎn)生能力、定殖能力進(jìn)行評估,然后通過盆栽試驗(yàn),探究了 SN15-2對青枯病害的盆栽防效;再采用透射電鏡和RNA-Seq技術(shù),探究該生防菌抑制青枯勞爾氏菌的機(jī)制。首先,對分離篩選到的生防菌株SN15-2進(jìn)行菌種鑒定,通過對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定,確定該菌株為熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens。熒光假單胞菌SN15-2可以產(chǎn)生噬鐵素并具有生物膜形成能力,但不能產(chǎn)生蛋白酶。通過對其抗生素基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及目的基因條帶測序,發(fā)現(xiàn)該菌株還產(chǎn)生2,4-二乙�；g苯三酚(2,4-DAPG)、硝吡咯菌素(PRN)、藤黃綠膿菌素(PLT)和氫氰酸(HCN)等物質(zhì)。采用利福平對SN15-2進(jìn)行抗性標(biāo)記,然后通過該菌株在番茄根際的定殖試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SN15-2具有良好的根際定殖能力,第60天的時(shí)候,在番茄根部的定殖菌數(shù)仍然有3.67×105CFU/g(干土)。通過盆栽試驗(yàn),探究熒光假單胞菌SN15-2對青枯病的防治效果,發(fā)現(xiàn)SN15-2的生防效果達(dá)到46.58%,對照組的硫酸鏈霉素的防治效果為32.67%,由此可見,SN15-2的生防效果明顯好于硫酸鏈霉素。其次,我們通過線性擬合法,計(jì)算了熒光假單胞菌SN15-2 48h發(fā)酵液對青枯勞爾氏菌12h的半抑制濃度,發(fā)現(xiàn)其半抑制濃度為23.4%。我們分別通過透射電鏡負(fù)染法和超薄切片法,研究了在半抑制濃度下,熒光假單胞菌SN15-2代謝產(chǎn)物對青枯勞爾氏菌的影響,發(fā)現(xiàn)SN15-2可以破壞該病原菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,并造成其細(xì)胞質(zhì)的溢出。最后,我們采用RNA-Seq技術(shù),探究了熒光假單胞菌SN15-2抑制青枯勞爾氏菌的分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)在SN15-2的代謝產(chǎn)物的脅迫作用下,青枯勞爾氏菌一共264個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。對表達(dá)量顯著變化的基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),SN15-2的代謝產(chǎn)物可以通過抑制整合膜蛋白的合成,造成細(xì)菌在生長和分裂的時(shí)候細(xì)胞膜的損傷;通過上調(diào)表達(dá)胞壁質(zhì)水解酶和下調(diào)表達(dá)二氨基庚二酸破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁;通過加強(qiáng)青枯勞爾氏菌核酸分解代謝同時(shí)抑制其核酸合成代謝,抑制青枯勞爾氏菌的增殖和代謝;SN15-2的代謝產(chǎn)物中含有噬鐵素可以給青枯勞爾氏菌造成鐵吸收壓力,影響青枯勞爾氏菌的生長和代謝。另一方面,為了抵抗熒光假單胞菌SN15-2的脅迫作用,青枯勞爾氏菌上調(diào)表達(dá)了熱激蛋白、DNA保護(hù)蛋白、有機(jī)氫過氧化物抗性蛋白和甘氨酸甜菜堿以減輕SN15-2對其細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA造成的損傷;同時(shí),多藥物抗性蛋白的上調(diào)使得青枯勞爾氏菌有更強(qiáng)的毒性物質(zhì)外排能力。然而,由于SN15-2代謝產(chǎn)物對青枯勞爾氏菌的毒性作用,青枯勞爾氏菌的廣譜抗性蛋白不但沒有在脅迫作用下上調(diào)表達(dá),反而是受到了抑制,這也暗示了在熒光假單胞菌SN15-2代謝物脅迫作用下,該病原菌的有些抗性機(jī)制已經(jīng)失效。本研究從土壤中分離得到一株防治青枯病的優(yōu)良菌株熒光假單胞菌SN15-2,豐富了防治青枯病的微生物資源,并探究了熒光假單胞菌SN15-2防治青枯勞爾氏菌的分子基礎(chǔ),為應(yīng)用生物防治技術(shù)防治青枯病害奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S476.1;S436.412.15
【圖文】：

圖１．１邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ試驗(yàn)流程逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ逡逑

sN15-2在光學(xué)顯徽鏡下的形態(tài)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2732865