發(fā)布時(shí)間：2020-06-24 13:32

【摘要】：核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib)de Bary)是一種世界性分布的典型的死體營(yíng)養(yǎng)型植物病原真菌;寄主范圍廣,能侵染至少75科278屬408種植物,包括重要的農(nóng)作物和果蔬,如大豆、菜豆、青豆、向日葵、油菜、番茄、青椒、萵苣及其它許多植物,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。MADS-box基因家族是真核生物中重要的轉(zhuǎn)錄因子,存在于植物、昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、真菌、低等脊椎動(dòng)物及哺乳動(dòng)物中,可調(diào)控初級(jí)代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞識(shí)別等多種細(xì)胞功能。本課題組前期克隆了核盤(pán)菌MADS-box基因家族轉(zhuǎn)錄因子SsMCM1,經(jīng)過(guò)研究表明SsMCM1具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,屬于MADS-box家族中的SRF亞族。SsMCM1基因功能的研究表明,SsMCM1參與調(diào)控核盤(pán)菌菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、致病力、有性生殖等方面。在此工作基礎(chǔ)上,為挖掘與SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白,建立SsMCM1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)開(kāi)展了如下研究:1、構(gòu)建了pGBKT7-SsMCM1載體,并將其轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞進(jìn)行毒性和自激活檢測(cè),結(jié)果表明pGBKT7-SsMCM1載體對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性,無(wú)自激活活性。利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)核盤(pán)菌c DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選和共轉(zhuǎn)驗(yàn)證,初步獲得13個(gè)與SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白,分別為:Ss IP31、Ss IP34、Ss IP37、Ss IP38、Ss IP43、Ss IP44、Ss IP63、Ss IP80、Ss IP86、Ss IP98、Ss IP99、Ss IP100、Ss IP106。2、對(duì)初步獲得的13個(gè)與SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白進(jìn)行測(cè)序、設(shè)計(jì)引物、克隆基因,并將其全長(zhǎng)基因連接到p GADT7載體上,與pGBKT7-SsMCM1載體共轉(zhuǎn)酵母,結(jié)果表明,初步篩選的互作蛋白中有12蛋白與SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子互作。3、對(duì)SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并結(jié)合釀酒酵母中MCM1轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)在核盤(pán)菌中存在一個(gè)與酵母MCM1轉(zhuǎn)錄因子下游蛋白Cdc28高度同源的蛋白SSIG_02296,經(jīng)克隆獲得該基因,將其命名為Ss Cdc28。然后構(gòu)建pGBKT7-Ss Cdc28載體,通過(guò)酵母雙雜交在已獲得的12個(gè)與SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白中,篩選出來(lái)一個(gè)與Ss Cdc28互作的蛋白Ss IP86。4、為進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白之間的互作,構(gòu)建了SsMCM1-Ss IP86雙分子熒光互補(bǔ)載體,進(jìn)行擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光觀察,結(jié)果表明SsMCM1與Ss IP86能進(jìn)行互作,且互作是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酵母雙雜交篩選出12個(gè)與SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白,雙分子熒光互補(bǔ)結(jié)果表明SsMCM1與Ss IP86能進(jìn)行互作,且互作是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行,克隆并獲得位于SsMCM1轉(zhuǎn)錄因子下游的蛋白Ss Cdc28,酵母雙雜交表明SsMCM1與Ss IP86互作,Ss IP86與Ss Cdc28互作,明晰了SsMCM1-Ss IP86-Ss Cdc28之間的互作關(guān)系,為解析核盤(pán)菌轉(zhuǎn)錄因子SsMCM1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S432.44

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本文編號(hào)：2727924