【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)作為昆蟲病原細菌,通過產(chǎn)生殺蟲蛋白對農(nóng)業(yè)害蟲幼蟲進行致死,對多種鱗翅目幼蟲,鞘翅目幼蟲等具有殺蟲活性,已經(jīng)在農(nóng)業(yè)害蟲防控方面具有廣泛應(yīng)用,是目前世界上應(yīng)用最成功的殺蟲微生物。Bt在生長穩(wěn)定期產(chǎn)生的Cry蛋白、Cyt殺蟲晶體蛋白以及Bt在營養(yǎng)期產(chǎn)生的Vip蛋白,而新發(fā)現(xiàn)的分泌期Sip類蛋白對鞘翅目幼蟲表現(xiàn)出較強的殺蟲毒性,目前鞘翅目害蟲在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的危害逐年加重,并且造成了嚴重的經(jīng)濟損失,所以深入研究Sip類蛋白對鞘翅目害蟲的控制具有重要意義。本研究從菌株QZL38成功克隆去除信號肽(前30個氨基酸)的截短sipa基因,基因編碼區(qū)長度為1005 bp,在大腸桿菌中成功表達約37 kDa的殺蟲蛋白,并對Sipa蛋白進行了純化。并對實驗室已有的Cry8Ca進行活化、表達、提取以及純化。對飼喂純化后的Sipa蛋白與Cry8Ca蛋白的大猿葉甲進行中腸組織病理學(xué)的電鏡觀察,結(jié)果顯示:飼喂Sipa蛋白大猿葉甲中腸組織出現(xiàn)微絨毛腫脹脫落、中腸細胞間隙擴大、細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹斷裂、線粒體中空變形等現(xiàn)象,說明Sipa蛋白對大猿葉甲的中腸組織具有破壞性,預(yù)測有相應(yīng)的受體蛋白。飼喂Cry8Ca蛋白的大猿葉甲中腸組織同樣出現(xiàn)微絨毛腫脹、脫落現(xiàn)象但中腸細胞間隙以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則無明顯變化,說明Cry8Ca蛋白對大猿葉甲的中腸組織具有十分輕微破壞性,在飼養(yǎng)過程中觀察發(fā)現(xiàn)對幼蟲有抑制進食、生長的作用。提取10 d的大猿葉甲幼蟲中腸的BBMV,用Sipa蛋白與大猿葉甲BBMV進行體外結(jié)合試驗,觀察結(jié)果:在37 kDa左右有清晰條帶,證實Sipa蛋白在大猿葉甲幼蟲中腸BBMV上有相應(yīng)受體。向大猿葉甲幼蟲中腸BBMV與Sipa蛋白已經(jīng)結(jié)合的反應(yīng)體系中,分別加入5倍、10倍、50倍和500倍過量的未標(biāo)記的Cry8Ca蛋白,進行競爭結(jié)合試驗。結(jié)果顯示500倍過量的Cry8Ca蛋白對Sipa蛋白在大猿葉甲中腸的結(jié)合沒有競爭作用,說明Cry8Ca蛋白與Sipa蛋白在大猿葉甲中腸BBMV上可能存在不同的受體。為延緩害蟲抗性的產(chǎn)生,發(fā)掘替代已商業(yè)化應(yīng)用、無交互抗性的新Bt基因成為一項緊迫的任務(wù)。進一步分離、鑒定不同種幼蟲中腸BBMV中Sipa蛋白的受體蛋白將有助于搞清Sipa蛋白作用機理和抗性機理。利用不同機制的蛋白為提高殺蟲活性拓寬思路,而且可以緩解昆蟲抗性產(chǎn)生,為Sipa蛋白定向進化改造和分子設(shè)計提供理論指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476.11
【圖文】：

圖 1-1 Domain I 的三維結(jié)構(gòu)[21]Fig. 1-1 3-D structure of Domain I[21]n II：是由一個β棱柱(β-prism)結(jié)構(gòu)組成，其中每個 -折疊片層由四個反形成經(jīng)典的“Greek Key”拓撲結(jié)構(gòu)[22]，如圖 1-2。不同的殺蟲蛋白之間可能與每種 Bt 蛋白的氨基酸序列不同有關(guān)。Domain II 中的 loop 環(huán)的不同，Rajamohan[24]等人研究表明 Domain II 是殺蟲蛋白與中腸受體的

圖 1-1 Domain I 的三維結(jié)構(gòu)[21]Fig. 1-1 3-D structure of Domain I[21]一個β棱柱(β-prism)結(jié)構(gòu)組成，其中每個 -折疊片層的“Greek Key”拓撲結(jié)構(gòu)[22]，如圖 1-2。不同的殺蟲種 Bt 蛋白的氨基酸序列不同有關(guān)。Domain II 中的jamohan[24]等人研究表明 Domain II 是殺蟲蛋白與中

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本文編號：2714107