【摘要】：辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是在世界范圍內(nèi)廣泛分布的毀滅性病害之一。辣椒疫霉有20余種寄主,主要侵染葉、果實和莖,引起軟腐、倒伏,可減產(chǎn)50%以上,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)造成數(shù)百億元經(jīng)濟(jì)損失。辣椒疫霉隸屬卵菌門,通過外泌效應(yīng)因子進(jìn)入植物質(zhì)外體或植物細(xì)胞破壞防御系統(tǒng)促進(jìn)病原菌侵染定殖。研究辣椒疫霉效應(yīng)因子與寄主的互作關(guān)系對于探究卵菌致病機制及寄主防衛(wèi)機制有重要意義。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉分泌357個RxLR類效應(yīng)分子,目前對于致病疫霉及大豆疫霉的致病機制已初步了解,但對于辣椒疫霉效應(yīng)因子與寄主的互作機制還缺乏研究。本研究以辣椒疫霉侵染時期上調(diào)表達(dá)的效應(yīng)因子PcRxLR129113為研究對象,篩選并鑒定了與PcRxLR129113互作的寄主靶標(biāo)蛋白,以期解析辣椒疫霉效應(yīng)因子的致病機制。主要研究內(nèi)容如下:1.通過農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)體系,對辣椒疫霉效應(yīng)因子PcRxLR129113進(jìn)行功能分析及亞細(xì)胞定位分析。在本氏煙上農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)PcRxLR129113,該效應(yīng)因子能夠抑制由INF1和Bax誘導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)。對PcRxLR129113進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析顯示,PcRxLR129113定位于植物細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核。2.使用酵母雙雜交(Y2H)篩選PcRxLR129113在辣椒內(nèi)的靶標(biāo)蛋白。首先,將公司構(gòu)建完成的辣椒cDNA質(zhì)粒文庫成功轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187中。對酵母文庫進(jìn)行質(zhì)量鑒定,鑒定結(jié)果為:滴度為1.13×10~6 CFU/mL,文庫的庫容量為1.7×10~7 CFU。其次,成功構(gòu)建了PcRxLR129113的誘餌載體,對誘餌蛋白進(jìn)行自激活檢測和毒性檢測均滿足要求。誘餌蛋白PcRxLR129113與辣椒文庫雜交后,檢測HIS3、URA3、LacZ三個報告基因的表達(dá),對疑似互作子進(jìn)行測序。經(jīng)分析驗證,篩選出9個互作蛋白,分別為乙醛脫氫酶,亮氨酸拉鏈類轉(zhuǎn)錄因子TGA1,果糖二磷酸醛縮酶,V型質(zhì)子泵,三磷酸甘油醛脫氫酶,葉綠素a,b結(jié)合蛋白,肌動蛋白解聚因子,鐵氧還蛋白,應(yīng)激蛋白。Y2H證明PcRxLR129113與乙醛脫氫酶、亮氨酸拉鏈類轉(zhuǎn)錄因子TGA1與互作。3.免疫共沉淀(co-IP)證明PcRxLR129113與乙醛脫氫酶互作。將植物表達(dá)重組載體PcRxLR129113、ALDH7在本氏煙葉片瞬時共表達(dá)48-60 h后提取葉片總蛋白進(jìn)行co-IP,證明PcRxLR129113與乙醛脫氫酶在體內(nèi)互作。4.雙分子熒光互補(BiFC)證明PcRxLR129113分別與乙醛脫氫酶、亮氨酸拉鏈類轉(zhuǎn)錄因子TGA1互作。農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)48-60 h,通過共聚焦顯微鏡成像,證明PcRxLR129113分別與乙醛脫氫酶、亮氨酸拉鏈類轉(zhuǎn)錄因子TGA1互作。5.RxLRW1-3為PcRxLR129113關(guān)鍵功能域,通過Y2H、BiFC和co-IP證明與ALDH7互作;通過Y2H和BiFC證明RxLRW1-3與TGA1互作。篩選辣椒疫霉效應(yīng)因子PcRxLR129113的宿主靶標(biāo)蛋白,研究靶標(biāo)蛋白在病菌侵染過程中如何調(diào)控植物的防衛(wèi)反應(yīng),為深入探究效應(yīng)因子PcRxLR129113的致病機制奠定基礎(chǔ),為開發(fā)植物廣譜抗病性生物農(nóng)藥提供理論依據(jù),為抗病性狀改良提供新途徑。
【圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文株中入侵、增殖，即為效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫在感病植株中，病原體逃避宿主 ETI，或通過效應(yīng)效應(yīng)因子觸發(fā)的感�。╡ffector-triggered susceptibi種機制完成，包括影響宿主轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)活動、變，，基因缺失，或通過 Avr 基因的轉(zhuǎn)錄沉默。因此水平特異性變異提供了多種效應(yīng)因子庫，應(yīng)對由力（Tao et al., 2003）。

辣椒疫霉菌效應(yīng)分子 RxLR129113 與辣椒互作蛋白的篩選鑒定合，從而啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄（Auerbach et al., 2003）；（2）并相互作用進(jìn)行分析，各種酵母雙雜交系統(tǒng)均有其適用范圍，因此表達(dá)體系以適應(yīng)不同蛋白互作驗證；（3）大量外源基因的表達(dá)可正常表達(dá)，存在假陰性。因此，蛋白質(zhì)間的相互作用還需其他方靠性。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.44

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本文編號：2641120