發(fā)布時(shí)間：2020-04-22 06:39

【摘要】：飛蝗(Locusta migrataria,Lm)是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲,主要以禾本科植物為食,具有繁殖力強(qiáng)、型變、遷飛等特點(diǎn),能給農(nóng)業(yè)帶來重大災(zāi)害。飛蝗屬于不完全變態(tài)昆蟲,其卵巢屬于無滋式,飛蝗卵細(xì)胞成熟所需要的卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)由脂肪體合成后分泌到血淋巴,最后由卵母細(xì)胞通過胞吞攝入。在許多昆蟲中,卵黃蛋白原的表達(dá)主要是受到體內(nèi)保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為,JH一方面能夠通過其受體Methoprene-tolerant(Met)介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑調(diào)控昆蟲卵黃蛋白原表達(dá);另一方面,JH通過其受體Met觸發(fā)其它轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),繼而間接調(diào)控Vg表達(dá)。除此之外,越來越多的證據(jù)表明,在昆蟲卵黃發(fā)生階段,體內(nèi)胰島素樣多肽(insulinlike peptide,ILP)信號(hào)通路能夠參與到Vg表達(dá)調(diào)控過程中。然而,目前關(guān)于JH和ILP信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控昆蟲卵黃蛋白原的分子機(jī)制并不清晰。據(jù)此,本論文根據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)探索,以飛蝗為研究對(duì)象圍繞JH和ILP信號(hào)通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控卵黃蛋白原表達(dá)的分子機(jī)制開展研究。飛蝗中有兩個(gè)Vg,被稱為VgA和VgB,通過RACE克隆得到了飛蝗VgA和VgB的cDNA全長序列,并構(gòu)建了其啟動(dòng)子區(qū)的雙熒光素酶報(bào)告載體,在S2細(xì)胞中進(jìn)行了激素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。成功制備了飛蝗Vg、Met和β-Actin抗體,檢測了飛蝗脂肪體Vg的mRNA和蛋白表達(dá)模式。飛蝗Vg的mRNA和蛋白水平表達(dá)結(jié)果表明,Vg在卵黃發(fā)生前期開始生成,在卵黃發(fā)生中期的表達(dá)水平達(dá)到峰值,然后在卵黃發(fā)生后期下降。Met蛋白的表達(dá)模式與Vg蛋白的表達(dá)模式相近,表明他們之間存在著相互聯(lián)系。RNA干擾Met后,Vg的表達(dá)受到了顯著的抑制。早熟素(precocene)處理剝奪內(nèi)源性保幼激素合成,再通過dsMet處理沉默Met,此時(shí)外源保幼激素類似物(methoprene)并不能誘導(dǎo)Vg的表達(dá),表明Met參與JH誘導(dǎo)Vg表達(dá)的信號(hào)通路。另一方面,通過干擾關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子ERK,抑制了飛蝗脂肪體中VgA和VgB的mRNA和蛋白表達(dá),表明ERK在飛蝗卵黃發(fā)生過程中起著重要作用。早熟素和dsERK共同處理,同樣顯著抑制methopren對(duì)飛蝗Vg的誘導(dǎo)表達(dá)。在蛋白表達(dá)譜測定結(jié)果中,ERK的磷酸化水平在羽化后0-3 d上升到一個(gè)峰值,之后開始下降,這個(gè)過程是先于Vg的表達(dá)完成的。而此時(shí)飛蝗的JH滴度很低,主要是胰島素在影響其發(fā)育,我們推測ERK磷酸化啟動(dòng)了飛蝗Vg的表達(dá)。根據(jù)這些結(jié)果推斷,ERK可能在ILP和JH信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控Vg表達(dá)過程中起重要作用。在飛蝗體內(nèi)激素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,ERK響應(yīng)JH誘導(dǎo),在30 min時(shí)達(dá)到了一個(gè)峰值。與ERK表達(dá)變化相類似,JH誘導(dǎo)VgA和VgB的表達(dá)也在30 min時(shí)顯著上升并達(dá)到了一個(gè)峰值。ILP也誘導(dǎo)VgA和VgB的表達(dá),但是兩者之間的變化略有不同。VgA是在30min上升到峰值,隨后下降到較低水平。VgB則是在上升到峰值后下降,但保持一定程度的表達(dá)。通過S2細(xì)胞中的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示,VgA和VgB的啟動(dòng)子活性在JH和ILP的誘導(dǎo)下顯著上升。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,保幼激素和胰島素都能誘導(dǎo)飛蝗中Vg表達(dá),Met和ERK在其中可能發(fā)揮重要作用。我們推斷,飛蝗卵黃發(fā)生與生殖過程由保幼激素和胰島素信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控。
【圖文】：

-1 大腸桿菌中原核表達(dá) Vg 蛋白部分片段和抗體特異性表達(dá)情況，2. IPTG 誘導(dǎo)后 Vg 蛋白表達(dá)情況，3. 超聲超聲波破碎后沉淀菌體中所含的蛋白表達(dá)情況，5. 使 檢測 Vg 抗體結(jié)果。SDS-PAGE 凝膠電泳所用凝膠濃度-1 Expression of Vg in Escherichia coli and specificity of 抗體制備基因片段選取的蛋白表達(dá)的片段長度為 612bp載體構(gòu)建選用的是 pET-30a，加上標(biāo)簽，最后誘的蛋白通過 Ni2+-His 親和層析柱純化，與弗氏佐耳白兔的皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫反應(yīng)，取血清

大腸桿菌中原核表達(dá) Met 蛋白部分片段和抗體特異表達(dá)情況，2. IPTG 誘導(dǎo)后 Met 蛋白表達(dá)情況，3. 超聲波破碎后沉淀菌體中所含的蛋白表達(dá)情況 5. 使測 Met 抗體結(jié)果。SDS-PAGE 凝膠電泳所用凝膠濃 Expression of Met in Escherichia coli and specificity o 的抗體制備 的基因片段選取的蛋白表達(dá)的片段長度為 29達(dá)的載體構(gòu)建選用的是 pET30a，，加上標(biāo)簽，來的蛋白通過 Ni2+-His 親和層析柱純化，與大耳白兔的皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫反應(yīng)，取血果可以看到對(duì)飛蝗的 β-Actin 蛋白有很強(qiáng)識(shí)別
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S433.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬世駿;;根除飛蝗災(zāi)害[J];科學(xué)通報(bào);1956年02期

本文編號(hào)：2636264