【摘要】：多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)是一類對植物生長有明顯促進作用的植物根際促生菌(Plant-growth-promoting rhizobacteria,PGPR),現(xiàn)已廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。多粘類芽孢桿菌SC2分離自辣椒根際,本文對多粘類芽孢桿菌SC2抗細菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化,并對抗細菌活性物質(zhì)進行了分離純化,主要內(nèi)容如下:以阿須貝培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,通過單因子試驗確定了最佳碳源、氮源、以及添加金屬離子對抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響。通過正交設計,響應面分析,確定抑菌率最大時的最優(yōu)培養(yǎng)基。最后最適的發(fā)酵溫度。結果表明蔗糖、硫酸銨為最佳碳氮源。除鎂離子外,錳離子、鋅離子對多粘類芽孢桿菌SC2胞外抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生均具有抑制作用,最終,確定SC2的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖43.60g/L、(NH_4)_2SO_4 6.66g/L、CaCO_3 6.26g/L、MgSO_4 0.2g/L、KH_2PO_4 0.2g/L、NaCl 0.2g/L,最佳發(fā)酵溫度為37℃、培養(yǎng)時間為60h。抗菌物質(zhì)的最終產(chǎn)量提高了大約4倍。為了獲得發(fā)酵液中較純的抗菌物質(zhì)并對其進行鑒定,本研究對其進行了分離純化。研究主要采用的方法包括萃取得到棕色粗提物,進行高效液相色譜(HPLC)分析。通過分析型HPLC分析,共發(fā)現(xiàn)了7個活性峰,保留時間分別為:5.5min、7.5min、9min、12.5min、16min、17.5min、23.5min。對7個活性峰收集并進行質(zhì)譜分析,確定了多粘類芽孢桿菌SC2產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中除多粘菌素P1、多粘菌素P2外還有五個未知的抗菌活性物質(zhì)。通過制備型HPLC分析,共發(fā)現(xiàn)5個活性峰,保留時間為11.1min、25.1min、27.8min、33.8min、34.9min。將各活性峰收集、濃縮后進行二次液相分離,優(yōu)化各峰洗脫條件,分離出抗菌活性物質(zhì)。通過質(zhì)譜分析技術,對活性物質(zhì)的含量、分子量及結構進行了分析,結果顯示:保留時間為11.1min的活性峰濃縮液經(jīng)二次分離后得到兩個純度較高的活性峰。經(jīng)過一級質(zhì)譜分析確定其分子量分別為1190、1176,與多粘菌素P2、多粘菌素P1分子量相一致。經(jīng)過二級質(zhì)譜分析確定其結構分別與多粘菌素P2、多粘菌素P1結構相同。保留時間為34.9min的活性峰濃縮液經(jīng)二次分離后得到兩個活性峰,一級質(zhì)譜分析確定其分子量分別為1230、1258,結構尚未明確。
【圖文】：

多粘菌素A1分子結構式Fig.1StructureofpolymyxinA1

圖 3-1 多粘類芽孢桿菌 SC2 的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)（放大倍數(shù)：10×100）olony morphology and thallus morphology of Paenibacillus polymyxa SC2 (magnificati多粘類芽孢桿菌 SC2 的純度，從甘油管活化菌株，37℃培養(yǎng)圖 3-1，菌落呈乳白色，表面粘稠。革蘭氏染色呈陽性，SC生抗逆性的橢圓形芽孢。源對抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響物質(zhì)產(chǎn)量，取重復與平行的平均值，結果如圖 3-2 所示。十有拮抗效果，且效果有明顯差異。本實驗中可溶性淀粉效果利于后期抗菌物質(zhì)的分離純化，故不選擇可溶性淀粉。蔗糖且蔗糖在工業(yè)應用上更為經(jīng)濟實用，故在后期的實驗中均采杯碟法檢測不同碳源對發(fā)酵效價影響的效果圖。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S182

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本文編號：2614677