【摘要】：多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)是一類對(duì)植物生長有明顯促進(jìn)作用的植物根際促生菌(Plant-growth-promoting rhizobacteria,PGPR),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。多粘類芽孢桿菌SC2分離自辣椒根際,本文對(duì)多粘類芽孢桿菌SC2抗細(xì)菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)抗細(xì)菌活性物質(zhì)進(jìn)行了分離純化,主要內(nèi)容如下:以阿須貝培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過單因子試驗(yàn)確定了最佳碳源、氮源、以及添加金屬離子對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響。通過正交設(shè)計(jì),響應(yīng)面分析,確定抑菌率最大時(shí)的最優(yōu)培養(yǎng)基。最后最適的發(fā)酵溫度。結(jié)果表明蔗糖、硫酸銨為最佳碳氮源。除鎂離子外,錳離子、鋅離子對(duì)多粘類芽孢桿菌SC2胞外抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生均具有抑制作用,最終,確定SC2的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖43.60g/L、(NH_4)_2SO_4 6.66g/L、CaCO_3 6.26g/L、MgSO_4 0.2g/L、KH_2PO_4 0.2g/L、NaCl 0.2g/L,最佳發(fā)酵溫度為37℃、培養(yǎng)時(shí)間為60h。抗菌物質(zhì)的最終產(chǎn)量提高了大約4倍。為了獲得發(fā)酵液中較純的抗菌物質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行鑒定,本研究對(duì)其進(jìn)行了分離純化。研究主要采用的方法包括萃取得到棕色粗提物,進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。通過分析型HPLC分析,共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)活性峰,保留時(shí)間分別為:5.5min、7.5min、9min、12.5min、16min、17.5min、23.5min。對(duì)7個(gè)活性峰收集并進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定了多粘類芽孢桿菌SC2產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中除多粘菌素P1、多粘菌素P2外還有五個(gè)未知的抗菌活性物質(zhì)。通過制備型HPLC分析,共發(fā)現(xiàn)5個(gè)活性峰,保留時(shí)間為11.1min、25.1min、27.8min、33.8min、34.9min。將各活性峰收集、濃縮后進(jìn)行二次液相分離,優(yōu)化各峰洗脫條件,分離出抗菌活性物質(zhì)。通過質(zhì)譜分析技術(shù),對(duì)活性物質(zhì)的含量、分子量及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示:保留時(shí)間為11.1min的活性峰濃縮液經(jīng)二次分離后得到兩個(gè)純度較高的活性峰。經(jīng)過一級(jí)質(zhì)譜分析確定其分子量分別為1190、1176,與多粘菌素P2、多粘菌素P1分子量相一致。經(jīng)過二級(jí)質(zhì)譜分析確定其結(jié)構(gòu)分別與多粘菌素P2、多粘菌素P1結(jié)構(gòu)相同。保留時(shí)間為34.9min的活性峰濃縮液經(jīng)二次分離后得到兩個(gè)活性峰,一級(jí)質(zhì)譜分析確定其分子量分別為1230、1258,結(jié)構(gòu)尚未明確。
【圖文】：

多粘菌素A1分子結(jié)構(gòu)式Fig.1StructureofpolymyxinA1

圖 3-1 多粘類芽孢桿菌 SC2 的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)（放大倍數(shù)：10×100）olony morphology and thallus morphology of Paenibacillus polymyxa SC2 (magnificati多粘類芽孢桿菌 SC2 的純度，從甘油管活化菌株，37℃培養(yǎng)圖 3-1，菌落呈乳白色，表面粘稠。革蘭氏染色呈陽性，SC生抗逆性的橢圓形芽孢。源對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響物質(zhì)產(chǎn)量，取重復(fù)與平行的平均值，結(jié)果如圖 3-2 所示。十有拮抗效果，且效果有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)中可溶性淀粉效果利于后期抗菌物質(zhì)的分離純化，故不選擇可溶性淀粉。蔗糖且蔗糖在工業(yè)應(yīng)用上更為經(jīng)濟(jì)實(shí)用，故在后期的實(shí)驗(yàn)中均采杯碟法檢測不同碳源對(duì)發(fā)酵效價(jià)影響的效果圖。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S182

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本文編號(hào)：2614677