【摘要】：飛蝗是不完全變態(tài)昆蟲的代表,為世界性的農(nóng)業(yè)害蟲,整個發(fā)育階段可分為卵期,若蟲期和成蟲期。飛蝗成蟲具有很強(qiáng)的生殖能力,是蝗災(zāi)暴發(fā)的重要內(nèi)因之一。飛蝗的生殖主要由保幼激素(Juvenile hormone,JH)調(diào)控,JH促進(jìn)脂肪體中卵黃生成(Vitellogenesis),大量合成的卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)通過血淋巴運(yùn)輸?shù)铰殉?進(jìn)而被卵母細(xì)胞吸收,發(fā)育為成熟的卵。miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的小分子非編碼RNA,通過抑制靶基因的翻譯或降解靶基因的mRNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控。我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),在雌性飛蝗成蟲中,miRNA的表達(dá)響應(yīng)JH滴度變化,并且干擾Ago1能夠阻斷miRNA作用通路,進(jìn)而抑制Vg合成、卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟,表明miRNA在雌性飛蝗的生殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但是miRNA具體的功能和調(diào)控機(jī)制并不明確。本論文研究綜合利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的方法,闡述了miR-2簇(miR-2/miR-13a/miR-13b/miR-71或miR-2～13～71)在飛蝗卵黃生成和卵母細(xì)胞成熟中的功能,解析了miR-2～13～71通過靶基因Notch調(diào)節(jié)飛蝗生殖的分子機(jī)制。我們首先利用二代高通量測序技術(shù),獲得雌性飛蝗脂肪體miRNA的轉(zhuǎn)錄組信息。結(jié)合飛蝗基因組信息,對miRNA在基因組中的組織形式進(jìn)行了分析,一共鑒定到25個成簇存在的miRNA。首先對覆蓋范圍在1500 nt之內(nèi)的5個miRNA cluster進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)兩個由保守miRNA組成的cluster。其中,位于scaffold29860的miR-2～13～71表達(dá)量在羽化后的正常發(fā)育中逐漸降低,進(jìn)一步外源JH類似物(JHA)的處理結(jié)果顯示,miR-2 cluster的表達(dá)被JHA抑制。通過體內(nèi)注射miRNA的激動劑(AgomiR)過表達(dá)miR-2～13～71,導(dǎo)致飛蝗卵巢生長減緩,卵母細(xì)胞發(fā)育受阻。統(tǒng)計(jì)卵小管中首卵的長度,實(shí)驗(yàn)組中卵小管首卵長度顯著變小,發(fā)育受到抑制。進(jìn)一步的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),miR-2～13～71抑制飛蝗脂肪體中VgA和VgB的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明,過表達(dá)miR-2～13～71抑制飛蝗Vg合成,進(jìn)而延緩卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟。利用miRanda軟件,我們在飛蝗轉(zhuǎn)錄組水平上大規(guī)模預(yù)測了miR-2～13～71的靶基因。KEGG分析發(fā)現(xiàn),Notch信號通路被顯著富集。雙螢光素酶報(bào)告基因和RNA免疫共沉淀的結(jié)果表明,Notch為miR-2～13～71的靶基因,過表達(dá)miR-2～13～71顯著抑制Notch的表達(dá)。同時,JH促進(jìn)Notch的轉(zhuǎn)錄,干擾Notch能夠抑制Vg的轉(zhuǎn)錄、卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟,與過表達(dá)miR-2～13～71產(chǎn)生的表型一致。根據(jù)上述研究結(jié)果,我們提出了miR-2～13～71通過靶基因Notch調(diào)控飛蝗卵黃生成和卵母細(xì)胞成熟的作用模型,即JH通過上調(diào)Notch的表達(dá),促進(jìn)飛蝗的卵巢發(fā)育;雖然miR-2～13～71下調(diào)Notch的表達(dá),但是JH可以抑制miR-2～13～71的表達(dá)進(jìn)而維持Notch的正常水平,從而促進(jìn)卵黃生成、卵巢發(fā)育和卵成熟。
【圖文】：

圖1-1 miRNA合成模式圖(Lucas et al., 2015)。Figure 1-1 Model of miRNA biogenesis(Lucas et al., 2015)NA 在昆蟲中的研究進(jìn)展A 作為一類重要的調(diào)控生長發(fā)育的小分子，在昆蟲激素調(diào)控的發(fā)育進(jìn)作用。這在果蠅(Sempere et al., 2003)、家蠶(Liu et al., 2018)、煙草aran et al., 2010)、德國小蠊(Rubio et al., 2012a)、飛蝗(Wang et al., 201都得到證實(shí)。在飛蝗中，過表達(dá) miR-133 抑制多巴胺合成途徑中兩個重 henna，使多巴胺合成減少，，致使蝗蟲由群居型轉(zhuǎn)變?yōu)樯⒕有汀Ｒ种?ma 和 pale 的表達(dá)，導(dǎo)致群居型向散居型轉(zhuǎn)變(Yang et al., 2014)。在果蠅中 到 Wnt/Wingless（Wg）信號通路，miR-8 和 wntless 結(jié)合，抑制 Wg 的 -8 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) miR-8 的缺失突變體對高溫敏感，腹部色素沉積減少異常造成化蛹缺陷(Kennell et al., 2008; Kennell et al., 2012)。miR-305 的

圖 3-1 miRNA 簇在飛蝗基因組中的定位。iRNA 前體，藍(lán)色為 miRNA 成熟體。右邊的柱狀圖顯示 5 個 miRNA 簇在正常發(fā)育飛肪體中的表達(dá)模式。0PAE 為羽化后 12h 內(nèi)。n = 3.Fig 3-1 The orgnization of miRNA cluster in locust genome.步對 miR-2~13~71 的 RNA 二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖 3-2A），發(fā)現(xiàn) miR-2/ miR/ miR-71 有具有明顯的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，具有 miRNA 的典型結(jié)構(gòu)。且在這個 c 有 3 個拷貝，miR-13a, miR-13b 和 miR-71 分別有一個拷貝。對 miR-2 c體的序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)（圖 3-2B），其中 miR-2, miR-13a 和 miR-13b 的，并且擁有相同的種子區(qū)序列，表明它們可能屬于同一個家族。進(jìn)一步通據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn) miR-2，miR-13a 和 miR-13b 同屬于 miR-2 家族。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S433.2

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本文編號：2593610