【摘要】：來曲唑(letrozole)是人工合成的芐三唑類衍生物,其可以抑制細胞色素P450芳香酶的活性,從而導致機體內雌激素水平的下降,一般用于乳腺癌的化療和放療。阿特拉津(atrazine)又名莠去津,屬三氮苯類除草劑,主要用于林果地和玉米田中一年生雜草的防治。近年來,有許多報道在城市污水、地表徑流、河流和湖泊中檢測到了來曲唑和阿特拉津的存在。由于來曲唑和阿特拉津不易降解,殘效期長和具有內分泌干擾作用的特點,其對水生環(huán)境和人類的健康已經構成了潛在的威脅。為進一步了解它們影響魚類繁殖和魚類性別魚類的內分泌干擾機制,本研究采用組織學和分子生物學方法來研究不同濃度的來曲唑(25μg/L,125μg/L,625μg/L)和阿特拉津(26.80μg/L,268μg/L,2680μg/L)暴露成年泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)7天,14天,21天后,雌性和雄性泥鰍性腺組織學變化,性別分化相關基因表達的變化。并通過利用高通量測序技術建立正常泥鰍和來曲唑以及阿特拉津處理后泥鰍的精巢、卵巢miRNA表達譜,初步探討來曲唑和阿特拉津處理下miRNA對泥鰍性腺發(fā)育和分化的影響。來曲唑處理結果顯示:與對照組相比,625μg/L來曲唑處理的雌魚初級卵母細胞的數量顯著減少;雄魚出現(xiàn)生精小管管腔擴張和精子數量的增加。六個性別發(fā)育和分化相關基因的mRNA表達水平,包括sox9a(sry-related HMG box-9a),sox9b(sry-related HMG box-9b),sf1(steroidogenic factor-1),dmrt1(double sex and mab-3 related transcription factor1)和amh(anti-Mullerian hormone)在精巢或卵巢中上調,但在兩性的大腦中沒有發(fā)生變化或者降低,除了ar(androgen receptor)表現(xiàn)出相反的表達模式。其他四個基因cyp19a(cytochrome P450 19a),foxl2(winged helix/forkhead transcription factor2),erα(estrogen receptorα)和erβ(estrogen receptorβ)在大腦和性腺中的表達則表現(xiàn)出濃度依賴性并具有性別和組織特異性。阿特拉津處理首先確定了阿特拉津對泥鰍的急性毒性,在此基礎上進行暴露實驗。實驗結果表明:阿特拉津對泥鰍的24h、48h、96h的半數致死濃度(LC50)分別為31.60mg/L、26.82mg/L、18.98mg/L,安全質量濃度(SC)為5.8mg/L。隨著阿特拉津濃度的升高和處理時間的增長,泥鰍的死亡率出現(xiàn)明顯的上升。通過組織學研究發(fā)現(xiàn)高濃度的阿特拉津(2680μg/L)能夠抑制泥鰍精巢精子的發(fā)生,促進卵巢細胞的發(fā)育。同時qRT-PCR結果顯示:與對照組相比不同劑量的阿特拉津能夠顯著的促進cyp19a,foxl2,erβ,sf1等基因的表達,而erα表現(xiàn)出相反的表達模式。對sox9a,sox9b,dmrt1和amh具有顯著的抑制效應。利用高通量測序技術分別建立了成熟泥鰍正常精巢和卵巢以及來曲唑、阿特拉津分別處理8h、24h的精巢和卵巢小RNA文庫,測序結果表明:泥鰍性腺中絕大多數短序列小RNA,長度集中在27-28bp,推測泥鰍性腺中存在大量的piRNA。利用加尾法設計引物,對兩個對比組(DC-S24hAC和DX-S24hLX)中隨機選取的表達具有顯著差異的兩個已知的泥鰍miRNA和兩個新預測的泥鰍miRNA(miR-138-x,miR-335-x,novel-m0694-5p,novel-m0301-3p;miR-130-x,miR-205-x,novel-m0279-5p,novel-m0333-5p)進行熒光定量PCR驗證,結果與測序結果一致,說明通過高通量測序獲得的mi RNA表達譜數據是可信的。利用三個靶基因預測軟件對全部1442個miRNAs進行靶基因預測,預測到共有143549個靶基因對應6415895個靶基因位點。在對靶基因預測結果分析中,我們預測得到了與性別相關的幾個基因(foxl2,erα,erβ,ar,dmrt3,cyp17等)。通過分析每個基因所對應的miRNAs,結合樣品間差異表達miRNAs的數據結果,我們發(fā)現(xiàn)一些miRNAs(mi R-181-y,let-7-x,miR-132-y等等)可能在魚類的性腺中發(fā)揮一定的作用。對這些樣品間差異表達miRNA的靶基因做了GO功能注釋后,發(fā)現(xiàn)各個組間差異表達miRNA作用的靶基因功能基本一致,都涉及到細胞發(fā)生,信號傳導,細胞膜及細胞膜組成,分子的結合,催化和轉錄等過程。
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【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X592;S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2449858