【摘要】：來曲唑(letrozole)是人工合成的芐三唑類衍生物,其可以抑制細(xì)胞色素P450芳香酶的活性,從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)雌激素水平的下降,一般用于乳腺癌的化療和放療。阿特拉津(atrazine)又名莠去津,屬三氮苯類除草劑,主要用于林果地和玉米田中一年生雜草的防治。近年來,有許多報(bào)道在城市污水、地表徑流、河流和湖泊中檢測(cè)到了來曲唑和阿特拉津的存在。由于來曲唑和阿特拉津不易降解,殘效期長(zhǎng)和具有內(nèi)分泌干擾作用的特點(diǎn),其對(duì)水生環(huán)境和人類的健康已經(jīng)構(gòu)成了潛在的威脅。為進(jìn)一步了解它們影響魚類繁殖和魚類性別魚類的內(nèi)分泌干擾機(jī)制,本研究采用組織學(xué)和分子生物學(xué)方法來研究不同濃度的來曲唑(25μg/L,125μg/L,625μg/L)和阿特拉津(26.80μg/L,268μg/L,2680μg/L)暴露成年泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)7天,14天,21天后,雌性和雄性泥鰍性腺組織學(xué)變化,性別分化相關(guān)基因表達(dá)的變化。并通過利用高通量測(cè)序技術(shù)建立正常泥鰍和來曲唑以及阿特拉津處理后泥鰍的精巢、卵巢miRNA表達(dá)譜,初步探討來曲唑和阿特拉津處理下miRNA對(duì)泥鰍性腺發(fā)育和分化的影響。來曲唑處理結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,625μg/L來曲唑處理的雌魚初級(jí)卵母細(xì)胞的數(shù)量顯著減少;雄魚出現(xiàn)生精小管管腔擴(kuò)張和精子數(shù)量的增加。六個(gè)性別發(fā)育和分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平,包括sox9a(sry-related HMG box-9a),sox9b(sry-related HMG box-9b),sf1(steroidogenic factor-1),dmrt1(double sex and mab-3 related transcription factor1)和amh(anti-Mullerian hormone)在精巢或卵巢中上調(diào),但在兩性的大腦中沒有發(fā)生變化或者降低,除了ar(androgen receptor)表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。其他四個(gè)基因cyp19a(cytochrome P450 19a),foxl2(winged helix/forkhead transcription factor2),erα(estrogen receptorα)和erβ(estrogen receptorβ)在大腦和性腺中的表達(dá)則表現(xiàn)出濃度依賴性并具有性別和組織特異性。阿特拉津處理首先確定了阿特拉津?qū)δ圉q的急性毒性,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:阿特拉津?qū)δ圉q的24h、48h、96h的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為31.60mg/L、26.82mg/L、18.98mg/L,安全質(zhì)量濃度(SC)為5.8mg/L。隨著阿特拉津濃度的升高和處理時(shí)間的增長(zhǎng),泥鰍的死亡率出現(xiàn)明顯的上升。通過組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高濃度的阿特拉津(2680μg/L)能夠抑制泥鰍精巢精子的發(fā)生,促進(jìn)卵巢細(xì)胞的發(fā)育。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比不同劑量的阿特拉津能夠顯著的促進(jìn)cyp19a,foxl2,erβ,sf1等基因的表達(dá),而erα表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。對(duì)sox9a,sox9b,dmrt1和amh具有顯著的抑制效應(yīng)。利用高通量測(cè)序技術(shù)分別建立了成熟泥鰍正常精巢和卵巢以及來曲唑、阿特拉津分別處理8h、24h的精巢和卵巢小RNA文庫(kù),測(cè)序結(jié)果表明:泥鰍性腺中絕大多數(shù)短序列小RNA,長(zhǎng)度集中在27-28bp,推測(cè)泥鰍性腺中存在大量的piRNA。利用加尾法設(shè)計(jì)引物,對(duì)兩個(gè)對(duì)比組(DC-S24hAC和DX-S24hLX)中隨機(jī)選取的表達(dá)具有顯著差異的兩個(gè)已知的泥鰍miRNA和兩個(gè)新預(yù)測(cè)的泥鰍miRNA(miR-138-x,miR-335-x,novel-m0694-5p,novel-m0301-3p;miR-130-x,miR-205-x,novel-m0279-5p,novel-m0333-5p)進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,說明通過高通量測(cè)序獲得的mi RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)是可信的。利用三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)全部1442個(gè)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)到共有143549個(gè)靶基因?qū)?yīng)6415895個(gè)靶基因位點(diǎn)。在對(duì)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果分析中,我們預(yù)測(cè)得到了與性別相關(guān)的幾個(gè)基因(foxl2,erα,erβ,ar,dmrt3,cyp17等)。通過分析每個(gè)基因所對(duì)應(yīng)的miRNAs,結(jié)合樣品間差異表達(dá)miRNAs的數(shù)據(jù)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)一些miRNAs(mi R-181-y,let-7-x,miR-132-y等等)可能在魚類的性腺中發(fā)揮一定的作用。對(duì)這些樣品間差異表達(dá)miRNA的靶基因做了GO功能注釋后,發(fā)現(xiàn)各個(gè)組間差異表達(dá)miRNA作用的靶基因功能基本一致,都涉及到細(xì)胞發(fā)生,信號(hào)傳導(dǎo),細(xì)胞膜及細(xì)胞膜組成,分子的結(jié)合,催化和轉(zhuǎn)錄等過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：X592;S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2449858