【摘要】：西花薊馬是為害園藝作物和經(jīng)濟(jì)作物的世界性害蟲。該蟲于2003年首次在北京發(fā)現(xiàn),之后迅速蔓延至我國(guó)的大部分地區(qū),為害日益嚴(yán)重。西花薊馬在入侵過程中,常常遭受夏季高溫脅迫,但這并未能限制其種群的快速擴(kuò)張。本文采用生理生化和分子生物學(xué)的方法,分析抗氧化酶系統(tǒng)在高溫脅迫條件下的作用,以了解西花薊馬對(duì)高溫脅迫的耐受機(jī)制,為西花薊馬種群擴(kuò)散研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：1.研究了高溫脅迫對(duì)西花薊馬抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明,西花薊馬受到0.5、1和2h的高溫脅后,超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性顯著升高而后降低；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性則在0.5h高溫處理?xiàng)l件下顯著升高,而在1和2h高溫脅迫下活性變化不顯著。說明西花薊馬抗氧化酶系統(tǒng)能夠有效抵御高溫脅迫對(duì)其造成的氧化損傷。2.通過RT-PCR技術(shù)克隆了7個(gè)西花薊馬內(nèi)參基因的部分片段,包括18SrRNA,EF-1、 GAPDH、H3、TUB、ACT和RPL32。利用qRT-PCT技術(shù)研究了西花薊馬7個(gè)內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性,運(yùn)用常用的內(nèi)參基因篩選程序(NormFinder、geNorm和BestKeeper)以及比較ΔCt法對(duì)各內(nèi)參基因進(jìn)行了排名,最后使用RefFinder網(wǎng)頁(yè)程序進(jìn)行綜合評(píng)估,得出最佳的內(nèi)參基因方案。最合適的內(nèi)參基因組合如下：不同發(fā)育階段為EF-1和RPL32；高溫脅迫為RPL32和GAPDH;低溫脅迫為18S和EF-1；高溫時(shí)間梯度為TUB和GAPDH;低溫時(shí)間梯度為EF-1和TUB。最后,對(duì)篩選的內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證,表明內(nèi)參基因的篩選對(duì)目的基因定量研究標(biāo)準(zhǔn)化非常必須。3.采用RT-PCR和RACE的方法從西花薊馬中克隆得到過氧化氫酶基因,命名為FoCAT。 FoCAT的cDNA全長(zhǎng)為1870bp,開放閱讀框?yàn)?521bp,編碼506個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為57.11kda。序列分析表明,FoCAT十分保守,與其他昆蟲的CAT具有很高的相似性,FoCAT具有兩個(gè)CAT家族的簽名序列,這也表明FoCAT屬于CAT基因家族的一員。采用實(shí)時(shí)定量PCR研究了西花薊馬過氧化氫酶基因在不同發(fā)育歷期和不同溫度條件下的表達(dá)模式。結(jié)果表明高溫脅迫能誘導(dǎo)CAT的表達(dá),而低溫脅迫對(duì)CAT表達(dá)的影響不顯著；CAT在西花薊馬二齡若蟲階段表達(dá)量顯著高于其它齡期的表達(dá)量；不論是高溫還是低溫不同時(shí)間梯度處理均導(dǎo)致CAT表達(dá)量顯著上調(diào),且在處理2h達(dá)到最高值。綜上所述,西花薊馬能夠耐受較強(qiáng)的高溫脅迫是其迅速入侵?jǐn)U散的重要基礎(chǔ),其內(nèi)在機(jī)制可能與抗氧化酶系統(tǒng)抵御高溫脅迫免受損傷有關(guān)。
[Abstract]:Western flower thrips are worldwide pests that harm horticultural and cash crops. The insect was first discovered in Beijing in 2003 and quickly spread to most parts of China. Western flower thrips are often subjected to high temperature stress in summer during invasion, but this does not limit the rapid expansion of their populations. In this paper, physiological and biochemical methods and molecular biology methods were used to analyze the role of antioxidant enzyme system under high temperature stress, in order to understand the tolerance mechanism of thrips to high temperature stress, and to provide a theoretical basis for the study of population diffusion of thrips westerners. The main findings are as follows: 1. The effects of high temperature stress on antioxidant enzyme activity of thrips were studied. The results showed that the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (catalase) were significantly increased and then decreased after being exposed to 0.5, 1 and 2 h high temperature stress in thrips. The activity of glutathione-S-transferase (GSH-S-transferase) increased significantly under 0.5 h high temperature stress, but not under 1 and 2 h high temperature stress. The results show that the antioxidant enzyme system of thrips can effectively resist oxidative damage caused by high temperature stress. 2. Seven fragments of the internal reference gene of thrips were cloned by RT-PCR technique, including 18s rRNA, EF 1, GAPDH,H3,TUB,ACT and RPL32.. The stability of seven internal reference genes of thrips japonicus under different experimental conditions was studied by means of qRT-PCT technique. The internal reference genes were ranked by the commonly used internal reference gene screening program (NormFinder,geNorm and BestKeeper) and the comparison of 螖 Ct method. Finally, the RefFinder web program was used for comprehensive evaluation, and the best internal reference gene scheme was obtained. The most suitable internal reference gene combinations were as follows: EF-1 and RPL32; high temperature stress was RPL32 and GAPDH; low temperature stress was 18s and EF-1; low temperature time gradient was TUB and GAPDH; low temperature time gradient was EF-1 and TUB.. Finally, the screening of internal reference genes was verified, indicating that the screening of internal reference genes is very necessary for the standardization of quantitative study of target genes. 3. The catalase gene was cloned from thistle by RT-PCR and RACE and named FoCAT.. The full-length cDNA of FoCAT is 1870bp, the open reading frame is 1521bp, encoding 506amino acids, and the predicted molecular weight is 57.11kda. Sequence analysis showed that FoCAT was very conservative and had high similarity to CAT of other insects. FoCAT had two signature sequences of CAT family, which also indicated that FoCAT belonged to one of the CAT gene families. Real-time quantitative PCR was used to study the expression patterns of catalase gene in thistle at different developmental stages and at different temperatures. The results showed that high temperature stress could induce the expression of CAT, but the effect of low temperature stress on the expression of CAT was not significant, and the expression level of CAT in the second instar nymphs of thrips was significantly higher than that of other ages. The expression of CAT was up-regulated at different time gradients both at high temperature and low temperature, and reached the highest value at 2 h after treatment. In conclusion, the ability of thrips to tolerate high temperature stress is an important basis for its rapid invasion and diffusion, and its intrinsic mechanism may be related to the protection of antioxidant system from damage under high temperature stress.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S433.89

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本文編號(hào)：2431668