【摘要】：氮素(N)是地球上最多的元素之一,但是在很多農業(yè)生產系統中常以植物不可利用的形態(tài)存在,因此N成為限制植物生長的主要因素。低投入系統中,常因為有機物料礦化緩慢,造成N缺乏,進而影響作物生長。因此有機系統產量相比常規(guī)系統較低�？紤]到在低投入系統中N素在農業(yè)生產中的關鍵作用,研究N動態(tài)變化過程對指導生產實踐顯得尤為重要。很多研究認為植物可以吸收和同化有機氮,有機氮具有作為重要N源的潛能。近年來,許多研究針對森林生態(tài)系統土壤有機氮庫進行了定量分析,而針對農田系統氮庫的研究鮮有報道。微生物群落的結構和變化過程在生物地球化學之間養(yǎng)分的循環(huán)中起關鍵作用,如受細菌和真菌介導的有機質降解和營養(yǎng)循環(huán)過程。大氣固氮作用同樣需要借助原核生物產生的固氮酶來發(fā)揮作用,它是許多生態(tài)系統的重要過程,同時也是低投入系統N素的重要來源。本課題組前期已對菜田土壤進行了一定程度的研究并在菜田土壤有機氮庫的組成和分布方面取得了一定的成果,因此,進一步研究栽培模式和土壤理化性質如何影響土壤中參與N轉化的微生物群落結構及其分布和豐度可更好地理解農業(yè)系統中氮的生物地球化學循環(huán)并為土壤可持續(xù)利用服務。本文以上海地區(qū)蔬菜生產系統為研究對象,采用固氮微生物群落的標記基因nifH,研究一年內不同生產方式(有機、常規(guī))和不同栽培方式(溫室和露地)園藝系統的固氮菌群落DNA的條帶和RNA的活性差異。用PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)研究固氮菌群落結構變化。用實時定量PCR(qPCR)測定nifH-harboring bacteria的豐度。將突出的DGGE條帶切下后測序用以研究固氮菌的種系組成。土壤樣品于2010年7月、11月、2011年2月和5月分別采自上海崇本堂有機生態(tài)農場和葉榭蔬菜園藝場。上海崇本堂有機生態(tài)農場,已有6年有機蔬菜栽培歷史;葉榭蔬菜園藝場有10年蔬菜常規(guī)種植歷史。兩種生產系統均包括露地和設施大棚兩種栽培模式,大棚和露地相鄰,土壤環(huán)境一致。在上述兩個地區(qū)4個處理(有機大棚、有機露地、常規(guī)大棚、常規(guī)露地)各選擇3個典型地塊作為三個重復,每地塊面積45m×50m。所選小區(qū)均具有相同的作物和茬次及其他農田管理措施。每個小區(qū)按s形用取土器取0-20cm土層土壤樣品8個點并混合作為一個重復。取樣后去除可見植物殘渣、石子等雜物,立刻存于自封袋內,放于事先準備好的冰盒中帶回實驗室。用相同的土壤樣品,以土壤微生物dna和rna的18srrna為目的片段,用pcr-dgge技術研究了土壤真菌群落多樣性。本研究進一步測定了與土壤微生物相關的土壤的特性(如:總碳、電導率、無機氮庫、有機氮庫和ph),確定影響真菌群落的土壤理化因子。另外,我們向有機和常規(guī)土壤中分別添加相同n量的:尿素,苜蓿、稻稈和堆肥,用以研究有機管理和肥料對氨基酸組分和含量的影響。試驗土壤于2013年3月,在上海崇本堂農場有機和常規(guī)生產系統露地種植區(qū)獲取,采樣方法同上。試驗共設8個處理:常規(guī)土壤,常規(guī)土壤+尿素,常規(guī)土壤+苜蓿,有機土壤,有機土壤+有機肥,有機土壤+尿素,有機土壤+秸稈,有機土壤+苜蓿。將尿素、苜蓿、有機肥、秸稈按照0.1mgng-1干土添加到250g土壤中,混合均勻放入580ml梅森瓶,每處理3次重復。將培養(yǎng)瓶置于人工氣候室,20±1℃,黑暗條件培養(yǎng),人工補水保持土壤含水量在最大持水量的50%。在培養(yǎng)的第1、3、7、15、28、42和56d破壞性取樣,測定土壤中氨基酸組分和含量,無機氮和微生物n含量。為研究肥料對細菌和真菌群落結構的影響,培養(yǎng)結束時用pcr-dgge的方法分別以16s和18srdna為目的片段研究細菌和真菌群落。將dgge圖譜中的dna目的條帶測序后得到群體結構的分類信息。培養(yǎng)過程中測定微生物群體,脫氫酶活性和呼吸作用的變化用以評價各處理對土壤質量的影響和肥料降解的動態(tài)變化。為了解有機土壤和所添加肥料對固氮能力的影響,采用靈敏度高的乙炔還原法(ara)周期性測定土壤培育過程中固氮酶活性。同時,測定其它土壤理化參數和生物參數以便確定對固氮能力影響最大的參數因子。培養(yǎng)結束時以nifh為目的片段采用dna-dgge的方法分析土壤的固氮菌群落。主要研究結果如下:(1)dgge圖譜聚類分析表明,在溫室種植模式中,有機生產管理的方式影響微生物群落結構,但是在露地種植模式下無此現象,從全碳的含量與微生物群落結構的相關性可以看出,兩種種植模式下施肥量的差異是造成該現象的主要原因。結果表明,定量pcr表明有機管理方式增加了固氮細菌的豐度和活性。在有機管理模式下和相對溫暖的月份,可溶性有機氮(son)含量較高,并與固氮細菌呈現了較好的相關性。圖譜中鑒定出的序列主要歸屬于固氮細菌、β-變性菌門、γ-變性菌門和α-變性菌門。其中24個條帶與pseudomonasstutzeri相似,8個條帶與azoarcusspp.相似。研究結果表明栽培模式可以改變季節(jié)和有機管理對固氮細菌影響的程度,大棚栽培可以顯著加強有機管理方式對固氮細菌的影響。同時,有機管理方式可以加強季節(jié)溫度對固氮細菌豐度和活性的影響從而增加生物固氮速率。同時,土壤dna和rna的聯合分析也給固氮菌群落提供了綜合的描述。(2)土壤dna指紋圖譜表明,真菌群落根據管理方式和栽培模式的不同而不同,但是cdna指紋圖譜表明季節(jié)更顯著影響真菌群落。土壤有機質、ec和銨態(tài)氮可以解釋指紋圖譜中觀察到的條帶差異。通過測序,常規(guī)土壤中的真菌多歸屬于pythiumultimum,alternariaspp.,fusariumoxysporum,sporisoriumreilianum和chaetomiumglobosum,有機土壤中的真菌多歸屬于cordycepsgunnii,18srdna和18srrna測序結果顯示它們之間僅有部分重疊。真菌數量以及活性的改變都說明了有機管理方式對土壤真菌群落產生了深遠的影響。由于溫室栽培而引起的真菌群落變化與增加的鹽分有關,其導致了真菌生物量的減少并增加了細菌的活性。這暗示了有機管理方中真菌產生的有益影響,可能會由于溫室栽培而減小。cdna-dgge圖譜可以更加靈敏的觀察到真菌群落的變化,并且是唯一發(fā)現了季節(jié)可產生影響的方法,這說明了在研究中將土壤dna和rna聯合分析比單獨以土壤dna為分析對象可以獲得更高的解析度,并由此發(fā)現真菌群落中沒有被注意到的重要變化。(3)土壤游離氨基酸庫主要由丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、色氨酸和纈氨酸組成。在土壤游離氨基酸的組分和濃度方面,有機和常規(guī)土壤沒有顯著差異。然而,堿性氨基酸組氨酸和賴氨酸僅僅存在于有機土壤,這可能與有機土壤有更多的土壤交換點有關。尿素可以顯著的改變游離氨基酸的組分,但僅僅存在于有機土壤中,說明在有機土壤里尿素對微生物的群落結構或者是它們的代謝途徑產生了影響。苜蓿和堆肥沒有改變游離氨基酸的組分和濃度。與此相反,培養(yǎng)土壤15天后,秸稈顯著的增加了游離氨基酸的含量,同時微生物生物量中的氮含量也增加了。在農業(yè)土壤中,即使在經過長期的有機管理方式,土壤中的游離氨基酸含量依然很低,并且主要成分穩(wěn)定,但是一些肥料卻能顯著的改變游離氨基酸的組分和含量,而這又影響到氨基酸態(tài)氮在植物吸收利用n素過程中所起到的作用。因此,值得對影響土壤游離氨基酸組分和含量的控制機制做進一步研究。(4)有機土壤中微生物生物量和脫氫酶酶活性較高。微生物生物量和脫氫酶酶活性對所添加肥料的響應,與肥料的種類以及土壤的管理背景有關。在有機土壤中,添加尿素會減少微生物生物量中的氮含量,但卻在常規(guī)土壤中增加了微生物生物量的氮含量。添加苜蓿僅僅在常規(guī)土壤中增加了微生物生物量的氮含量。添加尿素沒有影響脫氫酶的活性,但是在常規(guī)土壤和有機土壤中加入苜蓿后都增加了脫氫酶的活性。添加秸稈顯著的增加了微生物生物量氮含量和脫氫酶的活性,但是有機堆肥對它們影響不大。有機和常規(guī)土壤中的細菌和真菌群落顯著不同。雖然添加秸稈和苜蓿對真菌和細菌的結構產生了微小的影響,但是短期的施肥沒有對微生物的群落產生大的影響。條帶測序結果顯示,細菌和真菌主要歸屬于γ-proteobacteria,firmicutes,acidobacteria和ascomycota。施肥影響土壤化學和生物特性,然而對于微生物群落結構的影響,長期的管理是必須的。研究結果表明,微生物特性對短期施肥的響應依賴于土壤管理的背景,這些響應可能是由土壤背景微生物群落的差異驅動的。(5)結果表明,有機土壤比常規(guī)土壤具有更強的潛在固氮能力。在有機土壤中,苜蓿和堆肥增加了潛在固氮能力,但是在土壤培養(yǎng)中的特殊時期,尿素和秸稈減小了潛在的固氮能力。與此相反,在常規(guī)土壤中添加苜蓿和尿素對潛在固氮能力沒有產生顯著的變化。溶解性有機碳和ph與潛在固氮能力顯著相關。dgge分析結果表明,在有機土壤和常規(guī)土壤中的微生物為簡單的群落,且兩者之間之間沒有差別,同時肥料的加入也只有有限的影響,因此,群落結構的不同不能解釋固氮潛力的不同。數據表明,固氮能力被種群的規(guī)模和活性驅動而不是由群落結構所驅動。這個研究說明了,對于大氣的潛在固氮能力,有機生產系統要比常規(guī)生產系統強,同時添加苜蓿和有機堆肥可以顯著增加這種潛力,然而需要進一步的研究去量化實際的固氮量。綜上所述,本文以菜田有機與常規(guī)栽培土壤為對象,以大棚和露地栽培為條件,在施用有機質或無機氮的情況下,系統分析了土壤氮形態(tài)、氨基酸組成、土壤理化性質、固氮細菌區(qū)系和固氮基因nifH的活性、微生物群落構成等,發(fā)現:有機條件下SON、總FAA和硝態(tài)氮含量、固氮細菌的豐度和nif H的活性、真菌多樣性、微生物生物量和脫氫酶活性等均顯著高于常規(guī)土壤。研究了在不同栽培模式(大棚和露地)中,有機蔬菜生產系統的土壤固氮菌群落結構多樣性;有機生產系統中有活性的nifH-harboring bacteria的豐度較高,具有固氮潛能,結果均表明有機生產土壤具有最大固定大氣N的潛能。發(fā)現了土壤氨基酸在農田土壤碳氮循環(huán)和對植物供氮過程中具有重要作用,肥料顯著影響土壤游離氨基酸濃度和成分,該影響進一步說明需要建立植物總氮需求與氨基酸氮吸收之間的聯系。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S154.3;S153
，

本文編號：2370242