【摘要】：精喹禾靈是一種高選擇性的芳氧苯氧丙酸酯類除草劑,主要應(yīng)用于棉花、大豆、油菜等闊葉作物田中一年生或多年生禾本科雜草出苗后的防治。其作用機制是通過抑制乙酰Co A羧化酶,破壞分生組織生長,使雜草壞死。精喹禾靈的廣泛使用及其在環(huán)境中的殘留和積累造成了全球性的環(huán)境污染和生態(tài)破壞。除了直接對土壤環(huán)境、水環(huán)境和大氣環(huán)境造成污染,精喹禾靈還能通過食物鏈在生物體內(nèi)富集,對生物特別是人類的健康造成危害。因此解決其在環(huán)境中的殘留問題已經(jīng)成為世界各國研究的熱點。精喹禾靈在環(huán)境中可以通過物理、化學(xué)和生物的方法進(jìn)行降解。其中,微生物降解因其投入少,避免二次污染等特點正日益受到人們的重視。本研究的意義在于,篩選高效精喹禾靈降解菌株,研究其降解特性,以期為精喹禾靈污染環(huán)境的修復(fù)提供理論依據(jù);同時克隆精喹禾靈降解關(guān)鍵酶的基因,實現(xiàn)其高效表達(dá),從而進(jìn)一步研究降解關(guān)鍵酶的酶學(xué)特性和催化機理。本研究采用富集培養(yǎng)法從安徽境內(nèi)精喹禾靈生產(chǎn)廠家的污水處理系統(tǒng)中分離到一株高效精喹禾靈降解菌株QE-9。根據(jù)表型特征、生理生化特征以及16S r RNA系統(tǒng)發(fā)育分析,將其鑒定為Ochrobactrum sp.QE-9。菌株QE-9在溫度20-42℃范圍內(nèi)生長良好,最適生長溫度為30℃,最適生長p H為7.0;最適生長碳氮源為葡萄糖和酵母粉;氯霉素抗性。菌株QE-9的最適降解溫度為30℃;最適降解p H為8.0;降解速率與接種量成正相關(guān);能夠在以精喹禾靈為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長,并在6 d內(nèi)對0.5 mmol?L-1的精喹禾靈降解率達(dá)到98%以上。采用SDS高鹽法從精喹禾靈降解菌株Ochrobactrum sp.QE-9中提取高質(zhì)量基因組DNA,通過鳥槍法構(gòu)建基因組DNA文庫,以透明圈為篩選標(biāo)記從大約12000個轉(zhuǎn)化子中篩選到一個陽性克隆子。通過序列測定和分析發(fā)現(xiàn)陽性克隆子的外源片段共有三個閱讀框(orf1-orf3),分別編碼β-內(nèi)酰胺酶、吡哆醇5’-磷酸氧化酶和膜蛋白。其中,orf1被命名為基因estqe,該基因長1149 bp,編碼382個氨基酸,在起始密碼子GTG的上游找到了㧟35區(qū)(TTCCCC)、㧟10區(qū)(TGCAAGAAT)以及距起始密碼子上游8 bp處的核糖體結(jié)合位點(AAGAGG)�；騟stqe編碼的Est QE蛋白氨基酸序列與來自Pseudomonas stutzeriβ-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列(AHY43609)具有99%的同源性。進(jìn)一步對Est QE氨基酸序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),該序列中含有酯酶第八家族以及C類β-內(nèi)酰胺酶典型的保守序列SCTK(S-X-X-K)以及另外兩個在酯酶第八家族成員中常見的L-L-X-H-X-X-G和YSN序列,但是在Est QE氨基酸序列中并沒有發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)酯酶家族的保守序列G-X-S-X-G,這一現(xiàn)象在其他酯酶第八家族成員的研究中也發(fā)現(xiàn)過。菌株QE-9不能在含有100 mg?L-1 Amp或PCN等β-內(nèi)酰胺類抗生素的LB平板上生長,說明Est QE并沒有β-內(nèi)酰胺酶活性,猜測是由于蛋白演化過程中三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致空間位阻使得蛋白活性的改變。Est QE氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明關(guān)鍵酶Est QE與來自Pseudomonas fluorescens的酯酶第八家族成員Est C(AAC60471)有最高的同源性(68%),屬于酯酶第八家族。另外,Est QE與其他AOPP類除草劑水解酶,精惡唑禾草靈水解酶Fe H(JF970231,KF601763,KP307927)、氰氟草酯水解酶Chb H(ADW65729)的同源性分別為34.7%、34.9%、12.5%和16.4%。PCR擴增基因estqe連接到表達(dá)載體p ET-29a(+)上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,實現(xiàn)了estqe在E.coli BL21(DE3)中的高效表達(dá),通過鎳離子親和層析的方法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化研究其酶學(xué)特性。純化后Est QE等電點約為6.5,自然狀態(tài)下的分子量為43 k Da與理論數(shù)值基本一致,說明Est QE是一個單體酶。LC-MS鑒定結(jié)果表明Est QE可以通過酯鍵的水解將精喹禾靈轉(zhuǎn)化為精喹禾靈酸,從而進(jìn)一步證明Est QE是一個酯酶。以精喹禾靈為底物對Est QE的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,其在25-55℃范圍內(nèi)其有很高的酶活力,最適反應(yīng)溫度為45℃;4℃保存2個月仍能保持93%的酶活力,50℃處理1 h酶活力也能保持在40%以上,說明其具有很高的熱穩(wěn)定性。在p H 5.0-9.0范圍內(nèi)Est QE都表現(xiàn)出較高的酶活力,p H 8.0時酶活力最高,p H 7.0到p H 9.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。1.0 mmol?L-1的Cu2+能嚴(yán)重抑制酶活性,而1.0 mmol?L-1的Ca2+和Mg2+則能分別將酶活力顯著提高至142%和122%;10mmol?L-1的蛋白抑制劑PMSF、p CMB、DEPC和1%的表面活性劑SDS能強烈抑制Est QE的活性。此外,Est QE能夠廣泛水解芳氧苯氧丙酸酯類除草劑,對各底物的催化效率為:精喹禾靈㧐精VA唑禾草靈㧐炔草酯㧐氰氟草酯㧐喹禾糠酯㧐高效氟吡甲禾靈。Est QE水解精喹禾靈的Km為142.6μM,Kcat值為48.2 s-1,催化效率值(Kcat/Km)為338s-1?m M-1。以上結(jié)果表明Est QE在芳氧苯氧丙酸酯類除草劑污染環(huán)境的修復(fù)方面具有巨大的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：淮北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：X172;X592

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本文編號：2280372