【摘要】：由于抗生素的過量使用,養(yǎng)殖環(huán)境及禽畜糞便中存在大量抗生素殘留及耐藥菌和耐藥基因。糞便被還田用于農(nóng)業(yè)種植中,可能成為土壤中耐藥菌及耐藥基因的來源之一。細(xì)菌耐藥及耐藥基因已成為危害人類健康的環(huán)境及食品問題。糞肥和土壤作為耐藥菌和耐藥基因的儲存環(huán)境和傳播介質(zhì)之一,其對耐藥菌和耐藥基因在環(huán)境中的傳播有重要影響。蔬菜是人類的基本生活食品,其中的耐藥菌及耐藥基因會通過食物鏈影響人類的健康安全。而非致病菌是耐藥基因的受體、供體和儲存中間體,因其數(shù)量眾多,占微生物生態(tài)系統(tǒng)中的大部分,在其中發(fā)生耐藥基因的水平遷移(HGT)事件的頻率可能更高,因此在耐藥基因的遷移中扮演了重要角色。因此開展施用有機(jī)肥對土壤及蔬菜中耐藥非致病菌及耐藥基因的影響研究,以及其中耐藥基因傳播風(fēng)險(xiǎn)的研究十分必要,可為農(nóng)業(yè)環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中抗生素耐藥菌的控制策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。本研究以土壤及生菜為研究對象,通過室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)、菌落培養(yǎng)、平板計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法,研究分析施用有機(jī)肥對土壤及生菜中對頭孢噻肟(CTX)、紅霉素(ERM)、磺胺(SUL)、四環(huán)素(TET)、強(qiáng)力霉素(DOX)、環(huán)丙沙星(CIP)6種抗生素耐藥性的非致病細(xì)菌數(shù)目和多重耐藥表型的影響;通過基因克隆構(gòu)建耐藥基因庫,耐藥基因篩查和測序研究施有機(jī)肥對土壤及生菜中整合酶基因intI和9種耐藥基因的豐度、組合類型,對含多重耐藥基因菌種類型的影響;最后采用質(zhì)粒提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析了耐藥基因的潛在傳播風(fēng)險(xiǎn)。主要結(jié)論如下:(1)施肥后明顯增加了土壤中CTX~r、SUL~r、ERM~r、TET~r、CiP~r數(shù)目,DOX~r在對照組和施肥組中均未檢出。施肥后15 d、30 d和45 d,施肥組CTX1·的數(shù)量均大于其他耐藥非致病菌1-2個(gè)數(shù)量級,數(shù)量達(dá)到10~8CFU·g~(-1),DOX~r最少,數(shù)量均為10~5CFU·g~(-1)。除DOX~r外,隨生菜的生長,施肥均增加土壤中所研究的其他5種耐藥非致病菌(CTX~r、SUL~r、ERM~r、TET~r、CIP~r)的數(shù)目,但對其影響逐漸減少。施肥15d和30d時(shí),對土壤中CTX~r、TET~r、CIP~r、DOX~r數(shù)目的影響顯著,其中對CTX~r、CIP~r數(shù)目影響極顯著,ERM~r在30d差異顯著,施肥45 d時(shí),即生菜采摘期時(shí),施肥僅對土壤中CIP~r數(shù)目影響顯著,對其他5種耐藥非致病菌影響均不顯著。施肥后土壤中多重耐藥菌比例增加,不同時(shí)間點(diǎn)多重耐藥菌比例均有不同程度的提高。(2)施肥會使生菜中的耐藥非致病菌的數(shù)目增加。無論施肥與否,除DOX~r在生菜中均未檢出外,生菜中其他5種耐藥非致病菌普遍存在。隨著種植時(shí)間的增長,施肥對土壤中SUL~r的影響逐漸增加,對CIP~r數(shù)目的影響先增加后減少,TET~r和CTX~r數(shù)目的影響逐漸減少,對ERM~r數(shù)目無明顯影響。施肥對CTX~r數(shù)目在15 d時(shí)影響最大,對TET~r在15 d和30 d時(shí)影響顯著,且15 d影響極顯著,施肥對其余耐藥非致病菌在15 d和30 d均無顯著影響,施肥45 d時(shí),即在生菜采摘期45 d時(shí),施肥對其中的耐藥非致病菌數(shù)目影響不顯著。施有機(jī)肥對生菜中耐藥菌的多重耐藥性沒有太大的影響,但是可以看出即使不施肥,生菜中也存在多重耐藥菌。(3)intI在土壤和生菜中普遍存在,和施肥與否無關(guān)。施肥后增加了土壤和生菜中intI、tet和sul基因的檢出率。土壤與生菜中不同tet基因類型變化均不同,sul基因中,檢出率差異性大小均為sul1sul2。(4)施肥后,土壤中tet基因中tetC檢出率明顯增加,其次為tetG、tetB、tetE、tetA、tetM,tetL基本無變化。施肥對土壤中tet基因的影響在30 d最大,在45 d基本無影響。(5)施肥后,生菜中tet基因中tetG檢出率明顯增加,其次為tetM、tetB,施肥組tetL和tetA檢出率小于對照組,tetC均未檢出。隨著時(shí)間的增長,施肥對生菜中tet基因的影響減弱甚至減少其中tet基因檢出率,對生菜中sul基因的影響增強(qiáng)。(6)施肥可以增加土壤和生菜中含多重耐藥基因的菌株和intI基因的檢出率,可能一定程度上增加抗性基因的水平遷移風(fēng)險(xiǎn)。(7)施有機(jī)肥均可增加土壤和生菜中多重耐藥菌株的菌種類型,且可以改變生菜多重耐藥基因組合的類型和豐度。施肥土壤與對照土壤中的含多重耐藥基因的菌種均主要為假單胞菌(Pseudomonas sp.)、短波單胞菌(Brevibacterium sp.)節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)。對照組與施肥組生菜中優(yōu)勢多重耐藥菌株均為假單胞菌(Pseiudomonas sp.)和短波單胞菌(Brevibacterium sp.),施肥引入較多的菌株為節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)。(8)在所選取的多重耐藥非致病菌的質(zhì)粒上均檢出intI基因及sul、tet耐藥基因,其中土壤及生菜中intI在質(zhì)粒上檢出率100%。因此土壤及生菜中的耐藥基因可能具有水平傳播風(fēng)險(xiǎn),還需要對這些質(zhì)粒的特點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Due to the overuse of antibiotics, a large number of antibiotic-resistant bacteria and genes exist in the farming environment and livestock excrement. Feces returned to farming may become one of the sources of drug-resistant bacteria and genes in soil. Bacterial resistance and genes of drug resistance have become environmental and food problems that endanger human health. Vegetables are the basic food for human life, in which drug-resistant bacteria and drug-resistant genes affect human health and safety through the food chain. Non-pathogenic bacteria are receptors for drug-resistant genes. Horizontal migration of drug-resistant genes (HGT) may occur more frequently in microbial ecosystems because of the large number of donor and storage intermediates, which play an important role in the migration of drug-resistant genes. It is necessary to study the influence of antibiotic resistance genes and the transmission risk of antibiotic resistance genes, which can provide scientific basis for the formulation of control strategies of antibiotic-resistant bacteria in agricultural environment and agricultural products. Effects of fertilizers on the number and multidrug resistance phenotypes of cefotaxime (CTX), erythromycin (ERM), sulfonamide (SUL), tetracycline (TET), doxycycline (DOX) and ciprofloxacin (CIP) resistant non-pathogenic bacteria in soils and lettuce; Resistance gene pool was constructed by gene cloning, resistance gene screening and sequencing. Finally, Plasmid Extraction and polymerase chain reaction (PCR) were used to analyze the potential transmission risk of drug-resistant genes. The main conclusions were as follows: (1) Fertilization significantly increased the number of CTX~r, SUL~r, ERM~r, TET~r and CiP~r in soil. The number of CTX1 ~ (-1) in the fertilizer group was higher than that in the other non-pathogenic bacteria (1-2 orders of magnitude) 15 days, 30 days and 45 days after fertilization. The number of CTX1 ~ (-1) in the fertilizer group was 10-8 CFU ~ (-1), and the number of DOX ~ (-1) was the smallest, all of which were 10-5 CFU (-1). Except DOX ~ (-1), the other five Non-drug-resistant non-pathogenic bacteria in the soil were increased with the growth of lettuce. The number of pathogenic bacteria (CTX~r, SUL~r, ERM~r, TET~r, CIP~r) decreased gradually, but the effect of Fertilization on the number of CTX~r, TET~r, CIP~r and DOX~r in soil was significant at 15 and 30 days of fertilization, especially on the number of CTX~r and CIP~r. ERM~r had significant difference at 30 days of fertilization, that is, at 45 days of lettuce picking stage, fertilization only had significant effect on the number of CIP~r in soil. (2) Fertilization could increase the number of drug-resistant non-pathogenic bacteria in lettuce. Except DOX~r, there were no other 5 species in lettuce except DOX~r. With the increase of planting time, the effect of Fertilization on the number of SUL~r in soil increases gradually, and then decreases. The effect of Fertilization on the number of TET~r and CTX~r decreases gradually, but has no significant effect on the number of ERM~r. Fertilization had no significant effect on the number of drug-resistant non-pathogenic bacteria on the 15th day and 30th day. Fertilization had no significant effect on the number of drug-resistant non-pathogenic bacteria on the 45th day, that is, on the 45th day of picking period. Multidrug-resistant bacteria also existed in lettuce. (3) InI was ubiquitous in soil and lettuce, and had nothing to do with fertilization. After fertilization, the detection rate of intI, tet and sul genes in soil and lettuce increased. The detection rate of tetC in lettuce was significantly increased, followed by tetG, tetB, tetE, tetA, tetM and tetL. Fertilization had the greatest effect on the Tet gene in soil at 30 days, but had no effect on it at 45 days. (5) After fertilization, the detection rate of tetG in lettuce was significantly increased, followed by tetM, tetB. The detection rate of tetL and tetA in fertilization group was lower than that in control group, and tetC was not detected. (6) Fertilization can increase the detection rate of strains and intI genes containing multiple resistance genes in soil and lettuce, which may increase the risk of horizontal migration of resistance genes to a certain extent. (2) Fertilization can increase the detection rate of strains and intI genes containing multiple resistance genes in lettuce. 7) Application of organic manure could increase the types of multi-drug resistant bacteria in soil and lettuce, and could change the type and abundance of multi-drug resistant genomic combination in lettuce. The dominant multidrug-resistant strains were Pseudomonas sp. and Brevibacterium sp. in the control group and the fertilization group. Arthrobacter sp. (8) InI gene and sul, tet resistance gene were detected in the plasmids of the selected multidrug-resistant non-pathogenic bacteria. The detection rate of intI in medium soil and lettuce was 100%. Therefore, the risk of horizontal transmission of drug-resistant genes in soil and lettuce may exist, and further study on the characteristics of these plasmids is needed.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S141

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本文編號：2206185