發(fā)布時(shí)間：2018-04-18 15:52

  本文選題：蘇云金芽孢桿菌 + Cry3A蛋白�。� 參考：《河北科技師范學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：Cry3A蛋白是蘇云金芽孢桿菌在芽胞產(chǎn)生時(shí)期分泌的一種δ內(nèi)毒素,可以特異性殺死鞘翅目昆蟲(chóng)。本研究通過(guò)表達(dá)含有α-胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)的Cry3A突變體蛋白Cry3Am,獲得Cry3A毒蛋白殺蟲(chóng)活性核心片段aCry3A,驗(yàn)證Cry3A毒素致死過(guò)程中多聚體離子通道的存在,探究Cry3A毒素非核心區(qū)域α1-α3的作用,并尋找增加Cry3A殺蟲(chóng)活性的辦法。具體方法如下:將實(shí)驗(yàn)室保存的pET28a-cry3am質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)突變體Cry3Am3蛋白;用α-胰凝乳蛋白酶對(duì)Cry3Am進(jìn)行酶切后獲得了55kD的有毒核心片段;參考鱗翅目昆蟲(chóng)刷狀緣膜囊泡(BBMV)的MgCl2沉降提取法,成功分離到了黃粉蟲(chóng)的BBMV;通過(guò)Western Blot對(duì)Cry3A會(huì)在BBMV上形成多聚體蛋白通道假說(shuō)進(jìn)行驗(yàn)證;將毒素與黃粉蟲(chóng)復(fù)合配方飼料混合飼喂給剛孵化的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng),評(píng)價(jià)突變體蛋白Cry3Am的致死性,探究非核心區(qū)域α1-α3片段的作用。其結(jié)果為化學(xué)發(fā)光后Western Blot形成的照片中活性片段aCry3A在110kD,165kD,225kD區(qū)域形成了陰影;在飼養(yǎng)復(fù)合飼料中混合0.12%毒素的情況下,Cry3Am的致死率為22.6%,aCry3A的致死率為24.1%,Cry3A的致死率為3.7%。本文通過(guò)對(duì)Cry3A與黃粉蟲(chóng)中腸BBMV結(jié)合特性的研究發(fā)現(xiàn)Cry3A毒素在致死過(guò)程中會(huì)形成多聚體蛋白通道,破壞昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞滲透壓平衡,Cry毒素非核心區(qū)域α1-α3片段對(duì)多聚體蛋白通道的形成沒(méi)有任何影響;在核心區(qū)域aCry3A和非核心區(qū)域α1-α3之間可以插入α-胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)的突變體蛋白Cry3Am可以提高Cry3A毒素的殺蟲(chóng)活性。
[Abstract]:Cry3A protein is a kind of 未 endotoxin secreted by Bacillus thuringiensis during the period of spore formation, which can specifically kill Coleoptera insects.In this study, Cry3A mutant Cry3Amwith 偽 -chymotrypsin was expressed to obtain the core fragment of Cry3A toxic protein insecticidal activity, aCry3A, to verify the existence of polymeric ion channels during the lethal process of Cry3A toxin.To explore the role of 偽 1- 偽 3 in the non-core region of Cry3A toxin and to find ways to increase the insecticidal activity of Cry3A.The specific methods were as follows: the pET28a-cry3am plasmid preserved in the laboratory was transferred into the receptive cells to express the mutant Cry3Am3 protein, and the toxic core fragment of 55kD was obtained after Cry3Am was digested with 偽 -chymotrypsin.Referring to the MgCl2 sedimentation method of Brush border vesicle (BBMV) of Lepidoptera insects, the Western Blot was used to verify the hypothesis that Cry3A would form a polymeric protein channel on BBMV.The toxin and the compound formula feed of powdery mildew were fed to newly hatched larvae of Molitor Molitor to evaluate the lethal effect of mutant protein Cry3Am, and to explore the role of 偽 1- 偽 3 fragment in non-core region.The results showed that the active fragment aCry3A formed by chemiluminescent Western Blot had a shadow in the 110kDX 165kDU 225kD region, and the mortality of Cry3Am was 22.6cm Cry3A when mixed with 0.12% toxin in the compound feed. The mortality rate of Cry3A was 24.1kD3 A (3.7kD).In this paper, we studied the binding characteristics of Cry3A to BBMV in the midgut of powdery mildew. We found that the Cry3A toxin forms a polymeric protein channel during the lethal process.Destroying the osmotic balance of insect midgut cells and destroying the 偽 1- 偽 3 fragment of the non-core region of Cry toxin had no effect on the formation of polymeric protein channels.Cry3Am, a mutant protein with 偽 -chymotrypsin restriction site inserted between the core region aCry3A and non-core region 偽 1- 偽 3, could increase the insecticidal activity of Cry3A toxin.
【學(xué)位授予單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S476.1

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本文編號(hào)：1769032