本文選題：球孢白僵菌　切入點：細胞壁完整性　出處：《西南大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：球孢白僵菌是一種重要的昆蟲病原真菌,目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林和衛(wèi)生害蟲的防治,并逐漸成為研究寄主與昆蟲互作的一個模式菌株。作為一種生防微生物,昆蟲病原真菌在應(yīng)用過程中易受田間干旱、紫外輻射和高溫等不利因素以及宿主昆蟲免疫反應(yīng)的影響,限制了生防真菌的防效穩(wěn)定性和應(yīng)用范圍。因此,研究昆蟲病原真菌逆境脅迫反應(yīng)及其與昆蟲互作的機制,具有理論與實踐的雙重意義。細胞壁作為真菌細胞的一道重要屏障,在真菌的生長、形態(tài)發(fā)生以及適應(yīng)環(huán)境等過程中均發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用,是研究昆蟲病原真菌逆境脅迫反應(yīng)及與昆蟲互作的一個重要靶標(biāo)。細胞壁完整性(CWI)途徑又被稱為slt2/mpkl/pkc1途徑,不僅調(diào)節(jié)細胞壁結(jié)構(gòu)、組成和功能,而且介導(dǎo)真菌的生長、發(fā)育以及逆境脅迫反應(yīng)等。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子Rlml是CWI途徑調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子之一,在酵母以及少數(shù)絲狀真菌中的功能已明確,但在不同的真菌中存在功能上的分化。CWI途徑MAPK Bbslt2是介導(dǎo)球孢白僵菌細胞壁結(jié)構(gòu)完整性的重要環(huán)節(jié),但其潛在靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子Rlml的功能,尚不明確。本論文克隆了球孢白僵菌Rlml同源蛋白的編碼基因Bbrlm1。通過基因敲除、回復(fù)互補和超量表達等手段研究了該基因與球孢白僵菌生長、發(fā)育、細胞壁完整性及侵染致病等生物學(xué)過程的關(guān)系。獲得如下主要結(jié)果：1. Bbrlm1基因的克隆通過搜索球孢白僵菌基因組序列獲得與釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉和煙曲霉等多種真菌Rlm1同源蛋白的編碼基因Bbrlm1。序列分析發(fā)現(xiàn),Bbrlm1含有1965 bp的開放閱讀框,推測編碼蛋白含有654個氨基酸,分子量約為70.08 kDa,pI為9.27,在N端第2-70 aa處含有一個保守的MADS-MEF2結(jié)構(gòu)域,在第365-516 aa間含有功能未知的DUF3827結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),Bbrlm1與蛹蟲草的rlmA聚為一類。2. Bbrlm1的功能研究Bbrlm1參與調(diào)節(jié)球孢白僵菌生長。為揭示Bbrlm1介導(dǎo)的生物學(xué)過程,利用同源重組及超量表達等策略獲得了相應(yīng)的突變體。培養(yǎng)特性分析發(fā)現(xiàn),Bbrlm1介導(dǎo)球孢白僵菌生長。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CZM)上,破壞Bbrlm1顯著降低了菌落的生長速率,而超量表達則加快了菌落的生長速率。在完全培養(yǎng)基(1/4 SDY)上,基因破壞(ΔBbrlm1)和超量表達(OE-Bbrlml)菌株的菌落生長均滯后于野生菌株。在1/4 SDY培養(yǎng)基上,ΔBbrlml氣生菌絲厚度明顯變薄,而OE-Bbrlml的氣生菌絲生長茂盛�？梢�,Bbrlm1影響球孢白僵菌生長,且與營養(yǎng)成分相關(guān)。Bbrlml介導(dǎo)球孢白僵菌產(chǎn)孢。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,破壞Bbrlm1顯著提高了菌株的分生孢子產(chǎn)量,而超量表達則降低了產(chǎn)孢量；在完全培養(yǎng)基上,ABbrlml和OE-Bbrlml產(chǎn)孢量與野生型無明顯差異。在完全培養(yǎng)條件下,基因破壞和超量表達均導(dǎo)致菌株芽生孢子產(chǎn)量顯著下降。由此表明,Bbrlm1參與調(diào)節(jié)球孢白僵菌分生孢子和芽生孢子產(chǎn)生等過程。Bbrlml介導(dǎo)球孢白僵菌的細胞壁完整性。敲除或超量表達Bbrlml影響菌株對細胞壁合成脅迫劑和高溫的敏感性,且因培養(yǎng)基不同而發(fā)生變化。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,ΔBbrlm1對熒光增白劑(CFW)的耐受性增強,而對SDS和高溫的敏感性增強,對剛果紅(CR)的敏感性則無明顯影響。超量表達Bbrlm1則導(dǎo)致菌株對細胞壁合成抑制劑CFW和CR耐受性增強,對SDS和高溫的敏感性則無明顯影響。在完全培養(yǎng)基上,ΔBbrlm1對CFW和SDS的敏感性增強,而對CR耐受性增強,對高溫的敏感性無明顯影響。OE-Bbrlm1則對CFW、CR、SDS和高溫的耐受性均增強。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),ΔBbrlml分生孢子細胞壁明顯變形,而芽生孢子細胞壁結(jié)構(gòu)與野生菌株無明顯差異。OE-Bbrlm1的分生孢子細胞壁不僅變形,而且變薄。OE-Bbrlml芽生孢子細胞形態(tài)正常,但細胞壁厚度也明顯變薄。由此表明,Bbrlm1依賴于營養(yǎng)的變化介導(dǎo)球孢白僵菌細胞壁結(jié)構(gòu)完整性。Bbrlml介導(dǎo)球孢白僵菌的高滲敏感性。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,ABbrlm1對高滲(山梨醇和NaCl)的敏感性增強,而OE-Bbrlml菌株的高滲敏感性無明顯變化。在完全培養(yǎng)基上,破壞和超量表達Bbrlm1均增強了菌株對高滲的耐受性。由此表明,Bbrlm1介導(dǎo)菌株對高滲脅迫的敏感性,且應(yīng)營養(yǎng)條件不同而發(fā)生變化。Bbrlml介導(dǎo)球孢白僵菌的毒力。生物測定結(jié)果表明,將分生孢子接種于大蠟螟幼蟲體壁時,ΔBbrlm1和OE-Bbrlm1毒力分別下降11%和7%；而通過注射接種分生孢子于昆蟲血腔時,ΔBbrlm1和OE-Bbrlm1的毒力也分別下降9%和13%。由此可見,Bbrlm1嚴(yán)格調(diào)節(jié)球孢白僵菌毒力,破壞和超量表達Bbrlm1均導(dǎo)致菌株毒力下降。Bbrlml參與調(diào)節(jié)球孢白僵菌的次級代謝。Bbrlm1依賴于pH值介導(dǎo)一種橙色色素的產(chǎn)生。ABbrlm1在酸性條件下橙色色素的合成增加,而在堿性條件下減少�？梢�,Bbrlm1參與球孢白僵菌次級代謝的調(diào)節(jié)。Bbrlml影響球孢白僵菌產(chǎn)酸。ABbrlml在液體培養(yǎng)條件下產(chǎn)酸大量增加,pH下降明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.12

【共引文獻】

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本文編號：1598229